唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及 成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

钙离子对人成骨细胞迁移与成骨分化的影响

目的 研究不同浓度Ca ²⁺对人成骨细胞迁移与成骨分化的影响,探讨促进迁移与成骨合适的Ca ²⁺浓度及相关机制。 方法 设置Ca ²⁺浓度,Transwell检测成骨细胞迁移;CCK-8法评估成骨细胞增殖;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞成骨分化相关基因的表达;茜素红染色检测成骨分化生成的矿化结节。钙敏感受体（CaSR）拮抗剂拮抗后,观察Ca ²⁺对人成骨细胞迁移与成骨分化的影响。 结果 在迁移实验中,2、4、6 mmol·L ^-1的Ca ²⁺在3个时间点（8、16、24 h）都能明显地促进人成骨细胞的迁移,10 mmol·L ^-1的Ca ²⁺在8 h时明显抑制迁移。2~10 mmol·L ^-1 Ca ²⁺能促进人成骨细胞的增殖、成骨分化与矿化,8、10 mmol·L ^-1的Ca ²⁺诱导的矿化作用更明显。CaSR拮抗降低Ca ²⁺诱导的人成骨细胞迁移与成骨分化作用。 结论 低浓度Ca ²⁺有利于人成骨细胞迁移,高浓度Ca ²⁺有利于人成骨细胞分化,4、6 mmol·L ^-1的Ca ²⁺能较明显地同时诱导人成骨细胞迁移与成骨分化,Ca ²⁺-CaSR通路参与相应的信号传导。     

猪软骨脱细胞基质对人脂肪干细胞增殖及分化的影响

目的 研究猪软骨脱细胞基质（pACM）对人脂肪干细胞（hADSCs）增殖及分化的影响。方法 将猪关节软骨进行脱细胞处理制备pACM并进行鉴定。分离培养hADSCs并分化鉴定。将不同浓度pACM与hADSCs共培养,以不添加pACM为对照组,通过CCK-8法检测pACM对hADSCs增殖能力的影响,通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法检测pACM对hADSCs成软骨分化的影响。结果 0.5、1.0、2.0 mg·mL ^-1 pACM组hADSCs细胞增殖速率与对照组无统计学差异,而4.0、8.0 mg·mL ^-1pACM组hADSCs细胞增殖速率低于对照组（P<0.05）。0.5、1.0、2.0 mg·mL ^-1 pACM组成软骨相关基因SOX-9、抗Ⅱ型胶原纤维α1（COL2A1）、抗蛋白聚糖（ACAN）及细胞黏附相关基因层黏连蛋白（LAMININ）的表达均高于对照组（P<0.05）,细胞干性相关基因Notch-1的表达低于对照组（P<0.05）,成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAr-γ）的表达各组间均无统计学差异（P>0.05）。成软骨相关蛋白SOX-9、COL2A1及ACAN的表达高于对照组（P<0.05）。结论 适宜浓度的pACM不会影响hADSCs的增殖,并且可以在基因水平上诱导其向成软骨方向分化。     

降钙素基因相关肽对成骨细胞OPN表达的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide, CGRP)对大鼠成骨细胞中骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)表达的影响。方法:胶原酶消化法培养大鼠原代成骨细胞,碱性磷酸酶染色及茜素红染色对成骨细胞进行鉴定。CCK-8细胞增殖实验筛选CGRP最适作用浓度。将合适浓度的CGRP作用于成骨细胞,qPCR和Western Blot检测OPNmRNA及蛋白的表达。结果:CGRP浓度为10^-9 mol/L时,大鼠成骨细胞的增殖活性最强。使用10^-9 mol/L浓度的CGRP作用于成骨细胞,成骨细胞中OPN mRNA及蛋白的表达在第3天明显上调(P<0.05)。结论:CGRP可以促进成骨细胞中OPN的表达。     

负载CGRP及SP的明胶缓释微球用于修复家兔骨质疏松模型骨缺损的研究

目的: 将负载不同浓度的降钙素基因相关肽(CGRP)及P物质(SP)的明胶缓释微球植入骨质疏松兔的股骨缺损中,观察其对骨缺损修复的影响。方法: 通过去势方法建立兔骨质松模型,利用乳化交联的方法制备负载不同浓度的CGRP及SP的明胶缓释微球。将24只骨质疏松兔随机分组,于股骨髁部制备骨缺损并分别植入负载10^-6 mol/L、10^-8 mol/L和10^-10 mol/L的SP以及CGRP的明胶微球,3个月后处死观察结果。结果: 负载不同浓度的CGRP及SP均能有效地促进成骨,影像学结果示SP在10^-6 mol/L时其骨体积分数最高,并且能有效提高骨小梁数量,降低骨小梁间的间距(P<0.05),CGRP在浓度为和10^-8 mol/L时效果即达到上述效果;而组织学结果示SP和CGRP均在浓度为10^-6 mol/L时其新生骨组织比例最高(P<0.05)。结论: 负载不同浓度的CGRP及SP均能有效地促进骨质疏松兔骨缺损的成骨,在所研究的浓度中,高浓度的效果优于低浓度的效果。     

神经肽P物质及骨形态发生蛋白信号通路在ST2细胞成骨分化过程中的作用

目的 探讨神经肽P物质（SP）在ST2细胞（小鼠骨髓间充质干细胞）成骨分化过程中的作用及机制,以期为颞下颌关节骨关节炎的治疗提供依据。方法 对第3代ST2细胞分别用0、10^-10、10^-8 、10^-6、10^-5 mol·L^-1 SP培养,24、48、72 h后采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。以10^-6 mol·L^-1 SP培养第3代ST2细胞1、3、5、7 d后,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清液中碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原蛋白（CollaⅠ）和骨钙素（OCN）的表达,免疫荧光染色检测细胞ALP活性。分别用SP、Noggin（骨形态发生蛋白信号通路抑制剂）、SP+Noggin和2%胎牛血清培养ST2细胞,采用ELISA法检测上清液中ALP、CollaⅠ和OCN的表达。结果 CCK-8结果显示,24、48、72 h时均以10^-6 mol·L^-1 SP促进ST2细胞增殖活性最为明显（P<0.01）。ELISA结果显示,ALP表达在5 d时较对照组差异最为明显（P<0.01）,CollaⅠ和OCN的表达在7 d时较对照组差异最为明显（P<0.05）;免疫荧光结果显示,ALP活性在5 d时最强;加入抑制剂Noggin后,ALP、CollaⅠ和OCN表达量均降低。结论 SP可促进ST2细胞增殖和成骨分化,骨形态发生蛋白信号通路可能参与了此过程。     

当归多糖对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响

目的 探讨当归多糖（ASP）对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨向分化的影响。方法 培养并收集第3代BMSCs进行成骨成脂分化诱导鉴定。将BMSCs分为3组进行培养：正常对照组（葡萄糖浓度5.5 mmol·L ^-1）、高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1）、ASP+高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1+40 mg·L ^-1 ASP）。CCK8检测各组BMSCs的增殖活性,茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测成骨活性。实时荧光定量聚合酶链反应检测成骨标记基因Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）mRNA及Wnt/β-catenin信号通路关键因子CyclinD1及β-catenin的mRNA表达。建立2型糖尿病大鼠模型,将大鼠分为3组：正常对照组（正常大鼠）、糖尿病组（糖尿病大鼠）、糖尿病+ASP组（糖尿病大鼠,ASP喂养）,制备大鼠胫骨骨缺损,进行组织学检测,观察骨缺损修复情况。结果 高糖组、ASP+高糖组的BMSCs增殖高于正常对照组（P<0.05）,高糖组和ASP+高糖组二者之间无统计学差异（P>0.05）。高糖组中BMSCs钙结节数量、碱性磷酸酶活性及Runx-2、OCN、Osx、COL-Ⅰ、CyclinD1、β-catenin的mRNA表达均低于正常对照组和ASP+高糖组（P<0.05）,正常对照组和ASP+高糖组之间无统计学差异（P<0.05）。组织学检测结果显示,糖尿病组骨小梁数量少于正常对照组和糖尿病+ASP组（P<0.05）,而正常对照组和糖尿病+ASP组二者之间无统计学差异（P>0.05）。结论 ASP可促进高糖状态下大鼠BMSCs的成骨分化及2型糖尿病大鼠的骨缺损修复,这种促进作用可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力

目的 探讨尼古丁对牙周膜干细胞（PDLSCs）增殖和成骨分化能力的调控作用,检测尼古丁能否通过调控Toll样受体4（TLR4）抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。方法 培养PDLSCs,采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志,WST-1试剂盒检测不同浓度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改变。采用茜素红染色观察PDLSCs经不同浓度尼古丁刺激和成骨诱导后的矿化结节生产情况。运用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测经尼古丁刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因和蛋白的改变,以及尼古丁联合TLR4抑制剂TAK-242刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因及蛋白的改变。结果 培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,证实为PDLSCs。与对照组相比,培养3 d后,尼古丁浓度为10^-4 mol·L^-1的PDLSCs的增殖能力受到明显抑制（P<0.05）;成骨诱导21 d后,10^-4 mol·L^-1尼古丁刺激组茜素红染色矿化结节明显减少。RT-PCR反应及Western blot显示：与对照组相比,尼古丁刺激组PDLSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因及蛋白表达量均降低（P<0.05）,加入TLR4抑制剂TAK-242后,尼古丁的抑制效应减弱。结论 尼古丁可能通过TLR4信号通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的 人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

低氧状态下骨细胞参与破骨细胞形成的作用机制研究

目的 探究低氧状态下骨细胞对破骨细胞形成的作用及其机制。方法 用去铁胺甲磺酸（DFO）刺激骨细胞系MLO-Y4建立体外低氧骨细胞培养体系。CCK-8实验检测DFO对MLO-Y4细胞增殖活性的影响;采用DFO处理后的MLO-Y4细胞培养液制备条件培养基诱导RAW264.7细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测;利用实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测DFO作用下MLO-Y4表达低氧诱导因子（HIF）-1α与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的情况;检测HIF-1α siRNA转染对MLO-Y4表达HIF-1α和RANKL的影响。结果 100 μmol·L ^-1 DFO作用24 h时MLO-Y4增殖活性升高,之后随着时间延长细胞增殖活性下降（P<0.01）。加入可溶性RANKL后,低氧组可见破骨细胞形成明显增加（P<0.001）。100 μmol·L ^-1 DFO作用下,HIF-1α mRNA表达稳定,RANKL mRNA的表达随时间明显变化,24 h时最高（P<0.01）;HIF-1α、RANKL蛋白表达升高（P<0.01）。低氧状态下siHIF-1α转染可降低HIF-1α和RANKL的表达（P<0.01）,破骨细胞减少（P<0.01）。结论 低氧状态下MLO-Y4可通过上调HIF-1α的蛋白水平促进RANKL的生成,进而加速RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

低氧状态下骨细胞参与破骨细胞形成的作用机制研究

目的 探究低氧状态下骨细胞对破骨细胞形成的作用及其机制。方法 用去铁胺甲磺酸（DFO）刺激骨细胞系MLO-Y4建立体外低氧骨细胞培养体系。CCK-8实验检测DFO对MLO-Y4细胞增殖活性的影响;采用DFO处理后的MLO-Y4细胞培养液制备条件培养基诱导RAW264.7细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测;利用实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测DFO作用下MLO-Y4表达低氧诱导因子（HIF）-1α与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的情况;检测HIF-1α siRNA转染对MLO-Y4表达HIF-1α和RANKL的影响。结果 100 μmol·L ^-1 DFO作用24 h时MLO-Y4增殖活性升高,之后随着时间延长细胞增殖活性下降（P<0.01）。加入可溶性RANKL后,低氧组可见破骨细胞形成明显增加（P<0.001）。100 μmol·L ^-1 DFO作用下,HIF-1α mRNA表达稳定,RANKL mRNA的表达随时间明显变化,24 h时最高（P<0.01）;HIF-1α、RANKL蛋白表达升高（P<0.01）。低氧状态下siHIF-1α转染可降低HIF-1α和RANKL的表达（P<0.01）,破骨细胞减少（P<0.01）。结论 低氧状态下MLO-Y4可通过上调HIF-1α的蛋白水平促进RANKL的生成,进而加速RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

Gli1阳性细胞在牙周组织发育中的时空分布特点及功能研究

目的 利用转基因小鼠探究牙周膜内Gli 阳性（Gli1 ⁺）细胞的表达分布以及Gli1 ⁺细胞在牙周组织发育过程中的作用。方法 收集3、6和8周龄Gli1 ^lacZ/+小鼠下颌骨,通过β-半乳糖苷酶组织化学染色（X-gal染色）观察牙周膜内Gli1 ⁺细胞的时间和空间分布特点。然后,通过注射他莫昔芬诱导3周龄Gli1-Cre ^ERT2/+;R26R ^tdTomato/+小鼠表达红色荧光蛋白tdTomato,对Gli1 ⁺细胞及其子代细胞（tdTomato ⁺细胞）进行动态追踪。结果 3周龄小鼠牙周膜内分布大量Gli1 ⁺细胞,随着年龄的增长,Gli1在牙周膜内的数量逐渐减少（P<0.05）。tdTomato ⁺细胞随着诱导时间的延长,数量逐渐增加（P<0.05）,且逐渐分化成熟为成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞。结论 牙周膜内Gli1 ⁺细胞具有多向分化的潜能,是牙周组织发育过程中重要的细胞来源。     

降钙素基因相关肽对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用研究

目的 探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤的保护作用及其潜在机制。方法1）构建细胞氧化损伤模型,将实验分为4组,H₂O₂组使用含不同浓度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 mol·L^-1）H₂O₂的培养液,CGRP+H₂O₂组使用含不同浓度（10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 mol·L^-1）CGRP的培养液预处理后再加入含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂的培养液,对照组为常规培养液,空白组不接种细胞。培养12、24、36、48 h后,CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选最佳建模浓度和CGRP对成骨细胞氧化损伤的最佳保护浓度。2）采用含10^-4 mol·L^-1 H₂O₂（H₂O₂组）、10^-8 mol·L^-1 CGRP（CGRP组）的培养液和10^-8 mol·L^-1 CGRP+10^-4 mol·L^-1 H₂O₂培养液（CGRP+H₂O₂组）、常规培养液（对照组）培养成骨细胞,测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性、活性氧（ROS）的含量以及炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。结果 1）在10^-4 mol·L^-1 H²O²时细胞增殖开始出现抑制（P<0.01）,并呈浓度和时间依赖性;10^-8 mol·L^-1 CGRP预处理后细胞增殖活性最高,与只加入10^-4 mol·L^-1 H₂O₂有统计学差异（P<0.01）。2）与H²O²组相比,CGRP+H₂O₂组SOD活性升高（P<0.01）,TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P<0.05）,ROS含量降低（P<0.01）。结论 H₂O₂会对MC3T3-E1成骨细胞造成氧化损伤,CGRP对MC3T3-E1成骨细胞氧化损伤具有保护作用。     

降钙素基因相关肽通过Hippo通路调控小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的 前期研究发现降钙素基因相关肽（CGRP）能够促进成骨细胞的生物学活性,为了进一步揭示CGRP在骨修复中的作用,检测CGRP对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响,并对Hippo通路在这个过程中的作用进行了初步探讨。方法 在体外诱导培养的BMSCs中加入不同浓度的CGRP,处理48 h后测试碱性磷酸酶（ALP）活性,以筛选的优势浓度;处理7 d后进行茜素红染色,分别检测细胞的分化情况。应用Western blot检测CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表达水平;利用Hippo通路抑制剂维替泊芬（Verteporfin）阻断下游Yap信号,逆转录聚合酶链反应检测其对成骨相关因子Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、Runt相关转录因子2（Runx2）mRNA的表达影响。结果 ALP活性检测结果显示,与空白对照组相比,10^-9、10^-8、10^-7 mol·L^-1浓度范围的CGRP都能显著促进小鼠ALP活性的增加（P<0.05）,以10^-8 mol·L^-1浓度的CGRP为最佳刺激浓度。用10^-8mol·L^-1浓度的CGRP处理后,茜素红染色显示钙化结节明显增多。CGRP能够显著上调p-Mst1/2蛋白的表达（P<0.05）;当运用了抑制剂Verteporfin时,显著降低了CGRP诱导的Runx2、ColⅠ mRNA的表达（P<0.05）。结论 CGRP能够促进小鼠BMSCs的成骨分化,且Hippo信号通路介导了CGRP作用于小鼠BMSCs成骨分化的过程。     

雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的： 应用17 β-雌二醇（E₂）作用于大鼠骨髓间充质干细胞,研究不同浓度雌激素对细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs）,加入0、10^-9和10^-7 mol/L不同浓度E₂,CCK-8及Annexin V/PI双染法检测E₂对细胞增殖与凋亡的影响。分别于成骨诱导后第1、3、5、7、11、14和21天,采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、ALP和钙结节染色,以及实时定量PCR等方法检测不同浓度E₂对细胞成骨向分化能力的影响。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：E₂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与凋亡未见明显影响,并能显著提高干细胞的成骨分化能力,浓度为10^-9 mol/L时促进作用最为明显。与对照组相比,加药组细胞ALP活性升高,钙结节形成增多,成骨相关基因（RUNX2、ALP、COL I、OCN）表达显著升高。结论：17 β-雌二醇能促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,体外浓度为10^-9 mol/L时,作用最为显著。