套式PCR技术检测肝细胞癌患者血清HBV DNA

应用套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ）技术检测了１６例肝细胞癌（ＨＣＣ）患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，并与ＰＣＲ结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交（ＰＣＲ－ＳＢＨ）的方法作了比较。２种方法灵敏度均可达１０￣（－５）ｐｇ。套式ＰＣＲ无需制备探针，试验周期短，更适于推广。１６例ＨＣＣ患者检出ＨＢＶＤＮＡ９例（５６．２５％）。ＨＢｓＡｇ阳性组９例检出４例，ＨＢｓＡｇ阴性组４例检出２例。３例未测ＨＢＶ血清标记物均检出ＨＢＶＤＮＡ。结果表明ＨＣＣ患者血清中仍有ＨＢＶＤＮＡ低水平复制，仍具传染性。     

慢性乙型肝炎患者HBV前C区基因突变与临床的关系

目的：探讨慢性乙型肝炎患者ＨＢＶ前Ｃ区基因变异与临床的关系。方法：应用３′－碱基特异性ＰＣＲ法（３′－ＢＳ－ＰＣＲ）。结果：５５例ＨＢＶＤＮＡ阳性慢性乙型肝炎患者中检出突变株２５例。突变株的检出主要集中在抗－ＨＢｅ阳性患者中，并随肝损害加重而增加，重型肝炎患者突变株检出率最高。ＨＢＶ、ＨＣＶ重叠感染者高于ＨＢＶ单纯感染者。结论：突变株感染者病情较重，预后差；抗－ＨＢｅ的出现并不完全意味着病情的缓解；ＨＣＶ的重叠感染可能是导致ＨＢＶ前Ｃ区基因突变的原因之一。     

PCR检测HBV—DNA及其临床意义探讨

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）检测肝炎患者血清中的乙肝病毒ＤＮＡ（ＨＢＶ－ＤＮＡ），以探讨ＰＣＲ技术在乙肝病毒感染诊断中的应用，及ＨＢＶ－ＤＮＡ与血清ＨＢＶ标记ＨＢＶ－Ｍ之间的关系。结果表明１１５例ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率与ＨＢＶ活动复制情况相一致，认为ＰＣＲ方法灵敏度高，特异性强，为早期发现病人的ＨＢＶ的隐性感染提供了可靠的手段。     

用聚合酶链反应检测乙肝患者血清中的HBV－DNA

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测了１１４例传染科门诊病人血清ＨＢＶ－ＤＮＡ，并与ＨＢＶ有关的血清学标志（ＨＢＶＭ）进行了比较。结果表明：在９２和ＪＨＢｓＡｇ（＋）病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者５０例，占５４．３４％；在２８例ＨＢｅＡｇ（＋）病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者２６例，占９２．８６％；在２０例ＨＢＶＭ均为阴性的病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者有６例，占３０．００％。证明ＰＣＲ法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ较用ＥＬＩＳＡ法检测抗原一抗体更加灵敏、可靠。     

原位PCR技术检测肝中HBV—DNA的应用

目的：探讨原位ＰＣＲ技术在ＨＢＶ低水平感染中的意义。方法：用原位ＰＣＲ方法检测４２例肝炎患者石蜡包埋肝组织的ＨＢＶ－ＤＮＡ并与原位杂交技术检测结果进行比较。结果：原位ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为５０％，明显高于原位杂交法（１９％，Ｐ〈０．０１），肝组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率与临床诊断无关。阳性杂交信号均位于肝细胞浆，呈簇状和弥散状分布。结论：原位ＰＣＲ检测肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ具有快速、灵敏、     

应用PCR技术诊断乙型肝炎母婴垂直传播的研究

目的了解本地区乙型肝炎（ＨＢＶ）母婴传播的现状，评价ＰＣＲ技术的应用价值。方法用ＰＣＲ技术对１５６例孕妇及１１２例新生儿进行了ＨＢＶ检测。结果孕妇ＨＢＶ感染率为１０．２６％，孕妇ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者，其新生儿ＨＢＶ感染率为５６．２５％。结论本地区新生儿ＨＢＶ感染率明显高于国内报道。ＰＣＲ技术用于诊断ＨＢＶ感染简便、快捷、可靠。     

肝癌组织中丙型肝炎病毒RNA的研究

对３０例原发性肝癌患者手术切除的癌及癌旁组织（共３８份标本）用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇－ＮＣ区）ＲＮＡ。结果，１０例（３３．３％）肝癌患者被ＨＣＶ感染，２３例（７６．７％）患者被乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染。用酶切分析可见，肝癌组织中的ＨＣＶ是ＩＩ、ＩＩＩ型。对部分标本用ＰＣＲ直接测定核苷酸序列，ＨＣＶ５＇－ＮＣ区相当保守，差异无显著意义。因１０例ＨＣＶ感染的肝癌患者中８例同时有ＨＢＶ感染，因此可能ＨＣＶ及ＨＢＶ构成的双重慢性感染是导致肝癌发生的因素之一。     

PCR与ELISA法检测乙肝血清标志物对比分析

用ＰＣＲ技术检测４８例肝病患者，５５例非肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ，ＥＬＩＳＡ法检测其血清五项标志物，肝病组ＰＣＲ阳性率为３１．３％，非肝病组ＰＣＡ阳性率为１１．４％。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｂ阳性组ＨＢＶ－ＤＮＡ１００％阳性；ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｂ阳性、ＨＢｅＡｂ阳性或阴性组ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性５０％；单项ＨＢｓＡｂ阳性组ＨＢＶＤＮＡ阳性２０％；五项标志物全阴ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性４．７％。结果表明，ＰＣＲ技术特异性强、敏感度高，但两种方法各有所长，不宜取代。     

乙肝病毒PCR产物的鉴定及单项抗HBc阳性血清的HBV基因扩增

本文报道ＨＢＶ基因扩增产物的限制性酶切分析和寡核苷酸探针杂交鉴定、应用血清ＨＢＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物制备基因探针和单项抗ＨＢｃ阳性血清的ＨＢＶ基因扩增。ＰＣＲ用ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ的Ｃ基因区共有序列为内外两对引物分单次或套式扩增，产物为６６ａｂｐ或４２８ｂｐ，两者序列中段共含－ＢｇＩⅡ酶切点并与一寡核苷酸探针同源。４２８ｂｐ产物被用以缺口平移标记３２Ｐ探针作斑点和转印杂交检测。结合分子杂交的ＰＣＲ结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２例无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，证实病毒低度复制和传染性。     

应用PCR和ELISA两种方法检测HBV的对比分析

用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ两种方法同时检测了３９７例含有ＨＢＶ．ＤＮＡ免疫标志物一项以上阳性的乙肝病人血清和５０例正常人血清，结果在３９７例具有一项以上阳性的ＨＢＶ免疫标志物血清中，有１８６例在ＰＣＲ法检出ＨＢＶ．ＤＮＡ阳性，为４６．９％，正常人全部为阴性，按ＨＢＳＡｇ阴性，阳性分组，则ＨＢＳＡｇ阳性２９９例，ＰＣＲ检出ＨＢＶ．ＤＮＡ阳性１７１例，阳性率为５７．２％，ＨＢＳＡｇ阴性９８例，ＰＣＲ检出ＨＢ     

EFFECTS OF MUTATIONS IN THE POLYMERASE GENE OF HEPATITIS B VIRUS GENOME ON LAMIVUDINE THERAPY

ffeStnn Objectif Wr les effets des mutations du motif YMDD (twineme thionineaSperticachoagurtic acid) de Ia --se dans le tw du virus d' optite B (HBV) sur Ie traitement antiviraI dlamivudine. mebo he mpnt d 'ADN du HBV contenant le nzotif me dens le gdne Pht obtenu mrM d pertir des 19 matw chroniques d' mptite B avec lerum ADN HBV witi f d la 48for rtins dutraitement d lamivudine. L' 8chantillon etait SUkt d I' analyse sdquentielle automatique. te infiuences desvarinbles des mutati…     

核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎病毒学突破/反弹的临床特点

目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者在应用核苷(酸)类似物[NA(s)]治疗过程中出现病毒学突破/反弹的临床特点及乙肝病毒(HBV)聚合酶基因突变模式。方法采用PCR产物直接测序法,对2008年10月-2011年5月在北京佑安医院门诊及住院部接受NA(s)抗病毒治疗过程中出现病毒学突破/反弹的70例CHB患者血清进行测序,回顾性分析其HBV逆转录基因的耐药突变模式及临床特点。结果 70例患者应用NA(s)中位治疗时间21(12～65)个月;HBV DNA定量平均水平(5.26±1.57)logcopies/ml;其中检测到HBV逆转录酶基因耐药的40(40/70)例,单NA(s)药耐药的30(30/40)例,多药耐药(MDR)的10例(10/40);出现生化学突破的31例;出现MDR的患者均有多NA(S)用药经历,与单药耐药比较差异有统计学意义(P<0.05);生化学反弹患者的HBV DNA定量水平高于无生化学反弹患者(P<0.05);检测出HBV逆转录酶耐药位点患者的HBV DNA水平高于未检测出耐药位点者(P<0.05);单药耐药与MDR患者HBV DNA水平及ALT水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论序贯多NA(s)抗病毒治疗可选择出多药耐药;多药耐药(MDR)与单药耐药患者生化学及HBV DNA水平无明显差异。     

泛昔洛韦治疗慢性乙型肝炎的近期疗效

为观察泛昔洛韦 (FCV)对慢性乙型肝炎的近期治疗效果 ,并评估其安全性 ,将 4 0例血清乙型肝炎病毒 脱氧核糖核酸 (HBV DNA)阳性的慢性乙型肝炎患者随机分成FCV治疗组 ( 2 0例 ) ,一般药物 (维生素C、复方益肝灵或葡醛内酯 )对照组 ( 2 0例 ) ,疗程均 1 6周。定期检测血清乙型肝炎病毒标志物和肝功能。结果 :疗程结束时FCV组ALT复常率为 6 5 % ( 1 3/2 0 ) ,治疗组明显高于对照组的 35 % ( 7/2 0 ) ,P <0 .0 1。HBV DNA定量明显下降 ( 2个数量级 )者 ,FCV组为 6 0 % ( 1 2 /2 0 ) ,高于对照组的 1 0 % ( 2 /2 0 ) ,P <0 .0 1。另外 ,FCV组有 6例HBeAg阴转 ,其中 3例转为抗HBe阳性 ,对照组无此现象 (P <0 .0 5 )。 2组的不良反应发生率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结果提示 :泛昔洛韦可明显降低血清HBV DNA水平 ,促进肝功能恢复 ,不良反应轻微 ,耐受性良好。     

拉米夫定对乙型肝炎病毒DNA复制及基因变异的影响

目的:研究拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)的疗效、乙型肝炎病毒(HBV)DNA P基因变异特点及编码蛋白质的二级结构.方法:提取HBV DNA后,半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub,DNAsis软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果:在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论:1年的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

Detection of hepatitis B virus polymerase variations resistant to lamivudine therapy

Objective To investigate variations in hepatitis B virus (HBV) polymerase gene in chronic HBV infected patients resistant to lamivudine therapy. Methods Specimens were obtained from nine patients with chronic HBV infection, who were resistant to lamivudine therapy. Partial segments of the HBV DNA polymerase gene we re amplified by polymerase chain reaction (PCR). Nucleotide sequence was performed using an applied 373 automated sequencer. Titre of HBV DNA was measured by branched DNA assay (Chiron). Results Of nine patients with HBV DNA positive after 64 weeks of treatment, five (56%) had variations in the highly conserved YMDD motif in domain C of the HBV polymerase, three of those were substitutions of isoleucine for methionine(M), and two were substitutions of valine(V) for methionine. Additionally, in two patients with variations characterized by substitutions of V for M, one had a simultaneous amino acid change from the first aspartic acid to glycine and this pattern of variation was not reported in other literatures. With respect to viremia, in two subjects with low titre of HBV DNA (&lt;100 MEq/ml), no variation was found in the YMDD motif, whereas in seven patients with high titre of HBV DBA (&gt;300 MEq/ml), five (71%) had variations in the YMDD motif. Conclusions Lamivudine is a potent anti-viral agent for treatment of chronic HBV infection. Resistance to lamivudine is likely caused by the variations in the YMDD motif of the HBV polymerase gene.     

慢性重型肝炎患者乙肝病毒C基因变异的初步研究

目的探讨乙肝病毒C基因变异与乙型肝炎患者病情的关系.方法用聚合酶链反应(PCR)对2份慢性重型乙型肝炎患者血清及1份乙肝病毒无症状携带者血清进行C基因扩增和克隆,经核苷酸序列分析,与我国HBV克隆株pADR1比较.结果乙肝病毒无症状携带者的C基因与pADR-1的基因相似;而慢重肝患者C基因变异率较高,各有19和14个核苷酸变异.结论乙肝病毒C基因的变异可能与重型肝炎的发生密切相关.     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效和基因变异的研究

目的就拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)1a的疗效、HBV DNA P基因变异特点及编码的蛋白质的二级结构加以研究.方法 提取HBV DNA后,经半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub、DNAsis 软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果 按照ALT水平分组,各组间促进ALT正常化没有明显差异.在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,还发现了2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论 1a的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

乙型肝炎病毒C基因多态性及其蛋白特性分析

目的:调查温州医学院大学生人群乙型肝炎病毒(HBV)C基因多态性及其HBc蛋白特性变化,为了解乙肝病毒核心抗原(HBcAg)变异提供理论依据。方法:采用HBV-C基因特异性引物对21份温州医学院大学生HBV携带者(血清学检测为大三阳患者)血清标本进行PCR扩增鉴定,并取19份PCR检测阳性产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNA Star软件分析HBV-C基因多态性及HBc蛋白特性的变化。结果:21份标本中,HBV-C DNA阳性率达90.48%(19/21),与标准基因序列(Gen Bank X01587)比较,HBV-C基因同源性为93.3%～95.1%。HBV-C基因分别形成51种突变模式,其中一处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也发生了相应的改变,此处氨基酸序列的第130处脯氨酸(Pro)突变为苏氨酸(Thr),其余标本均为同义突变;但突变处编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性与标准株相比较无明显变化。结论:温州医学院大学生HBV携带者的HBV C基因具有多态性,但是由C基因决定的核心蛋白序列相对保守。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法 根据已公布的HBVDNA序列，在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeⅠ）酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序，结果 （1）所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便，快速，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时；灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBVDNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实，（2）应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测，发现YMDD变异者（45%）9例，YMDD野毒株者（55%）11例，表明该方法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株，结论 本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单，敏感，特异，适合于一般实验室应用及大规模的人群调查。