氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的 克隆人氨基末端B型钠尿肽（NT-proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白.方法 用聚合酶链反应（PCR）从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白.结果经PCR扩增成功获得228 bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Western blot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34 600.经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7 mg/100 ml.结论 NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础.     

氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化

目的克隆人氨基末端B型钠尿肽(NT-proBNP)基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白。方法用聚合酶链反应(PCR)从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列。构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白。结果经PCR扩增成功获得228bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34600。经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7mg/100ml。结论NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础。     

B型钠尿肽抗原的融合蛋白基因构建和表达

目的利用pGEX4T-2表达系统表达制备重组人B型钠尿肽(BNP)抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：2172639人BNPDNA序列，设计合成编码BNP-32蛋白的DNA，并分别在5’端和3’端设计BamHⅠ及XhoⅠ位点，经两步聚合酶链反应(PCR)、T-A克隆后，亚克隆至经BamHⅠ及XhoⅠ酶切的pGEX-4T-2载体，把重组质粒转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达，Glutathione sephsrose 4B亲和层析制备GST-BNP。通过DNA测序、融合蛋白的分子量分析和Western-blot来证实GST-BNP质粒及表达的B型钠尿肽(BNP-32)抗原的正确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码BNP-32的DNA准确插入pGEX-4T-2多克隆位点，成功构建了GST-BNP的表达质粒；诱导表达超声破碎后，GST-BNP蛋白主要存在于上清液中，经亲和层析回收融合蛋白，每升诱导菌可得融合蛋白10．6mg；Western-blot证实制备的融合蛋白是人BNP-32。结论通过基因工程技术制备的人BNP抗原，既具有免疫原性又具有反应原性，能很好地解决酶免分析中的基本要素抗原(被检测物)和相应的抗体。     

鲍曼不动杆菌Hcp基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 获取鲍曼不动杆菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）核心组分溶血素共调节蛋白（Hcp）。方法 根据ATCC17978菌株Hcp基因序列设计并合成一对含XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点的特异性引物,利用PCR方法扩增Hcp基因全长,定向克隆至含His标签的pET-28a(+)载体,采用PCR、双酶切和测序技术验证载体是否构建成功,进而转化Escherichia coli (E.coli) BL21(DE3)菌株,以IPTG诱导表达Hcp蛋白,分析目的蛋白的表达方式及最佳表达条件,通过Western blot鉴定目的蛋白,超滤管浓缩并保存。结果 获得了预期500bp左右的Hcp基因,并成功克隆至pET-28a(+)质粒,经IPTG诱导表达,成功纯化出Hcp融合蛋白。结论 成功获得鲍曼不动杆菌Hcp基因的原核表达产物,为深入研究T6SS及Hcp奠定了基础。     

B型钠尿肽及N端B型钠尿肽原水平与心力衰竭患者心功能的关系

目的研究心力衰竭（HF）患者B型钠尿肽（BNP）、N端B型钠尿肽原（NT—pro BNP）水平与HF患者心功能分级的相关性。方法分别采用免疫放射试验（IRMA）及酶联免疫吸附法（ELISA）测定86例HF患者和30例有呼吸困难的非HE患者（对照组）BNP、NT—proBNP水平并以多普勒超声诊断仪测定左窒射血分数（LVEF）。结果BNP、NT—proBNP水平随心功能NYHA分级程度的加重而显著增高,并与LVEF呈负相关,分别为r=-0．39,P〈0．0l;r=-0．35,P〈0．0l,HF患者BNP、NT—proBNP血浆浓度值呈高度相关（r=0．91,P〈0．001）。BNP、NT-proBNP用于HF诊断的效果以受试者工作特征（ROC）曲线下面积表示分别为0．916、0．926（P〉0．05）。结论BNP、NT—proBNP均可用于HF早期诊断及HF严重程度的评价,并可用于呼吸困难患者的鉴别诊断。     

B型钠尿肽研究进展

B型钠尿肽(BNP)作为一种主要由心室分泌的多肽类神经激素，在血容量稳定中起重要作用。血浆中的BNP水平在许多病理生理状态下均有所改变，尤以心力衰竭为甚。诸多研究表明，BNP在心力衰竭(HF)、急性心肌梗死(AMI)等心血管疾病的诊断及预后判断等方面有重要价值。由于BNP的测定简便易行，准确可靠，近年来在心血管疾病的诊疗中日益得到广泛应用。     

肥胖对心力衰竭患者B型钠尿肽表达的影响

目的:探讨肥胖在心力衰竭患者B型钠尿肽表达中的影响.方法:102例心力衰竭患者.接成人体质量指数分为正常组、体质量超重组和肥胖组,比较3组间B型钠尿肤水平;以65岁为界限将102例心力衰竭患者分为2组,比较2组肥胖者与非肥胖者B型钠尿肽水平.结果:肥胖组B型钠尿肽水平明显低于正常组和体质量超重组.结论:肥胖是影响心力衰竭患者B型钠尿钛水平的重要独立因子.     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

B型钠尿肽研究进展

B型钠尿肽 (BNP)作为一种主要由心室分泌的多肽类神经激素 ,在血容量稳定中起重要作用。血浆中的BNP水平在许多病理生理状态下均有所改变 ,尤以心力衰竭为甚。诸多研究表明 ,BNP在心力衰竭 (HF)、急性心肌梗死 (AMI)等心血管疾病的诊断及预后判断等方面有重要价值。由于BNP的测定简便易行 ,准确可靠 ,近年来在心血管疾病的诊疗中日益得到广泛应用。     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

乳腺珠蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化研究

目的 克隆乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMAM）编码全长cDNA,原核表达并纯化蛋白产物,为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础,从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。方法 自乳腺癌组织提取总RNA,通过RT-PCR克隆hMAMcDNA,构建pQFA0-hMAM表达质粒,在大肠杆菌M15中表达,利用镍-亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果 表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在,纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论 成功地纯化出hMAM重组蛋白。     

B-type natriuretic peptide in pediatrics

OBJECTIVES: There has been growing interest in the use of serum B-type natriuretic peptide (BNP) and the N-terminal segment of its pro-hormone (NT-proBNP) as biomarkers for cardiac disease. The aim of this review is to summarize the current state of knowledge regarding BNP and NT-proBNP measurement in the pediatric population. DESIGN AND METHODS: A computerized literature search on the National Library of Medicine was done and all articles including BNP and pediatrics were selected and discussed. RESULTS: The data from several studies suggest that the measurement of BNP may be useful in diagnosing and managing pediatric heart failure, congenital heart disease, cardiac transplantation and patients on chemotherapy. There are difficulties in establishing appropriate reference ranges in children. CONCLUSION: There is insufficient evidence for the routine use of BNP or NT-proBNP. Further research to clearly define the clinical utility in the pediatric age group is eagerly anticipated.     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的研究

目的：通过获得编码血小板生成素（Ｔｐｏ）成熟肽Ｎ端１～１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２上。结果：转化重组质粒ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＴｐｏＭ的大肠杆菌经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导４～５小时，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白（ＭＢＰ／ＴｐｏＭ）的分子量约为６．３万。薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的３７％。结论：经ＰＣＲ方法扩增的Ｔｐｏ基因突变体可在大肠杆菌中高效表达，为Ｔｐｏ突变体的进一步结构和功能研究以及Ｔｐｏ抗体的制备打下了基础。     

血浆脑钠肽在急性冠状动脉综合征中的意义

目的 研究脑钠肽(BNP)在急性冠状动脉综合征(ACS)中的临床意义.方法 选择2006年5月至2008年6月间我院住院的急性冠状动脉综合征患者151例,同期住院的高血压患者212例为对照组.均常规检测血脂、血糖、血常规、肾功能、超敏C-反应蛋白、脑钠肽(BNP);并记录患者血压、心率、吸烟史及高血压、糖尿病、高血脂等病史;同时检测常规心脏超声.结果 ACS组与对照组在年龄[(69.0±10.9)与(62.0±14.2)岁,t=5.043,P＜0.001]、血肌酐[(95.0±67.4)与(72.8 4-29.0) μmol/L,t=4.164,P＜0.001]、血尿酸[(360.2±104.4)与(300.8±92.7) μmol/L,t=5.521,P＜0.001]、BNP(80.81与352.38 ng/L,Z=-7.295,P＜0.001)、hs-CRP(7.99与17.08 mg/L,Z=-3.983,P＜0.001)、外周血[WBC(7.843±3.025)×109/L与(6.333±3.569)×109/L,t=4.209,P＜0.001]、单核细胞[(0.522±0.201)×109/L与(0.417±0.157)×109/L,t=5.084,P＜0.001]、血糖[(6.518±2.303)与(5.691±2.085)mmol/L,t=3.461,P=0.001]、收缩压[(134.7±27.8)与(142.0±26.3)mm Hg,t=2.536,P=0.012]等指标差异均有统计学意义.2组间吸烟比例[43.7%(66/151)和23.1%(49/212),X2=17.283,P＜0.001]、男性比例[74.8%(113/151)和48.6%(103/212),X2=25.217,P＜0.001]差异亦有统计学意义.经过多因素回归分析发现:年龄(X2=10.369,P=0.001)、性别(X2=12.836,P＜0.001)、BNP(X2=4.807,P=0.028)、WBC(X2=10.788,P=0.001)是造成2组间差异的主要原因.在ACS组,BNP与患者的左心室射血分数值之间存在线性关系(t=5.789,P＜0.001).结论 高龄、男性、外周血WBC和BNP与ACS存在密切关系,而BNP更对ACS患者的预后具有一定的预测价值.     

人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得重组人心肌型脂肪酸结合蛋白,为进一步开发应用奠定基础。方法根据已报道的心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因序列,采用RT-PCR的方法获得心肌型脂肪酸结合蛋白基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE-H-FABP)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果序列分析表明:H-FABP基因成熟肽编码区含有396bp,编码132个氨基酸;与GenBank(NM004012)中已报道的H-FABP分离物的核苷酸序列有99·9%同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的27%,分子质量约为15kDa并与商品化的H-FABP单抗(Clone6B6)呈特异性反应。经Ni 2-NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论在大肠杆菌中获得了人心肌型脂肪酸结合蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

B-type natriuretic peptide and weaning from mechanical ventilation

Objective Cardiac function and volume status could play a critical role in the setting of weaning failure. B-type natriuretic peptide (BNP) is a powerful marker of cardiac dysfunction. We assessed the value of BNP during the weaning process.Design, setting and patients One hundred and two consecutive patients considered ready to undergo a 1-h weaning trial (T-piece or low-pressure support level) were prospectively included in a medical intensive care unit of a university hospital. Weaning was considered successful if the patient passed the trial and sustained spontaneous breathing for more than 48 h after extubation.Interventions Plasma BNP was measured just before the trial in all patients, and at the end of the trial in the first 60 patients.Results Overall, 42 patients (41.2%) failed the weaning process (37 patients failed the trial and 5 failed extubation). Logistic regression analysis identified high BNP level before the trial and the product of airway pressure and breathing frequency during ventilation as independent risk factors for weaning failure. BNP values were not different at the end of the trial. In nine of the patients in whom the weaning process failed, it succeeded on a later occasion after diuretic therapy. Their BNP level before weaning decreased between the two attempts (517 vs 226 pg/ml, p = 0.01). In survivors, BNP level was significantly correlated to weaning duration (rho = 0.52, p < 0.01).Conclusions Baseline plasma BNP level before the first weaning attempt is higher in patients with subsequent weaning failure and correlates to weaning duration.Electronic supplementary material Supplementary material is available in the online version of this article at and is accessible for authorized users.Support was provided solely from institutional and departmental sources.     

B型钠尿肽在急性主动脉夹层中的表达意义

目的 探讨急性主动脉夹层(AAD)患者血清B型钠尿肽(BNP)水平与病情程度及预后的关系.方法 测定42例AAD患者血清BNP浓度,根据血清BNP增高的程度将42例患者分为A、B2组.A组23例,BNP峰值≥500 ng/L;B组19例,BNP＜ 500 ng/L.分析血清BNP浓度与病情程度及预后的关系.结果 42例AAD患者BNP浓度均增高,A组中发生夹层继续分离及住院期间病死率分别为47.83％( 11/23)、26.09％ (6/23),明显高于B组[15.79％(3/19)、0],差异均有统计学意义(P值分别为0.048、0.024).结论 AAD患者血清中的BNP浓度与病情程度及预后有关.     

B型利钠肽对严重感染及感染性休克患者预后的预测作用

目的 评价B型利钠肽(BNP)对严重感染及感染性休克预后的预测作用.方法 观察102例严重感染及感染性休克患者入重症监护病房(ICU)24 h血浆BNP水平、临床及预后相关资料.将患者分为28 d死亡组和存活组,比较其差异性,并用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价BNP水平对死亡的预测作用;进一步将存活患者分为BNP升高组和正常组,比较其差异性.结果 死亡组(39例)患者急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分显著高于存活组[63例,(28.9±5.9)分比(20.2±5.4)分,P<0.013,但两组白细胞计数、血乳酸值则差异无统计学意义.死亡组患者血浆BNP水平[(1 451.3±531.7)ng/L]明显高于存活组((394.55±81.7)ng/L,P<0.01);以血浆BNP水平>681.4 ng/L作为预测死亡的界点,敏感度为91.4%,特异性为80.3%.在存活组患者中,BNP升高组(48例)的ICU住院天数[(23.75±7.5)d]明显长于正常组(15例,(14.9±5.1)d,P<0.053;但两组APACHE 评分则差异无统计学意义.结论 血浆BNP水平可以预测严重感染及感染性休克的预后.     

B型脑钠肽评估维持性血液透析患者容量负荷的临床研究

探讨B型脑钠肽（B—type natriuretic peptide,BNP）与维持性血液透析患者（maintenance hemodialysiS,MHD）容量负荷关系的临床意义。方法选择北京同仁医院血液透析中心MHD患者87例,测定血浆BNP水平,根据BNP水平从低到高将患者分为4组,随访3个月,观察BNP水平变化与MHD患者容量负荷变化之间的关系。结果基础血浆BNP水平最低的组1,3个月后患者透析后体质量较前无明显变化[（70．12±13．60）kg比（70．01±13．5）kg,P=0．772],BNP水平较前无明显变化[74．4（43．0～110．9）ng／ml比66．7（23．6～125．4）ng／ml,P=0．184]。基础血浆BNP水平较高的的组2、组3、组4,3个月后患者透析后体质量、BNP水平较前显著降低（P〈0.05）。组2患者透析后体质量较前明显下降[（65．01±14．05）kg比（65．49±14．42）kg,P=0.003],BNP水平显著降低[161．1（73．5±280．8）ng／ml比180．5（129．0±275．9）ng／ml,P=0．039]。组3患者透析后体质量明显下降[（65．23±9．26）kg比（66．19±9．05）kg,P=0．000],BNP显著降低[220．0（124．8～311．0）ng／ml比371．3（276．8±427．3）ng／ml,P=0．000]。组4患者透析后体质量明显下降[（70．32±14．90）kg比（73．11±15．90）kg,P=0.000],BNP显著降低[641．0（232．0±3521．0）ng／ml比2276．5（679．8±3789．0）ng／ml,P=0．000]。MHD患者基础血浆BNP水平越高,3月后透析后体质量下降越明显,基础血浆BNP水平与透析后体质量下降呈正相关（R=0．763,P〈0.001）。随诊3个月中,患者透析前收缩压变化、透析后体质重变化、白蛋白及血红蛋白水平变化与MHD患者血浆BNP水平变化相关（月=0.740,R=0．507）。血浆BNP水平评估MHD患者透析后体质量变化的ROC曲线下面积为0．918（P〈0.001）,最佳诊断分界点为276ng／ml。结论血浆BNP水平可作为临床上评估MHD患者容量负荷增加的一个有效参考指标。