重构型Caspase-3基因对CNE2细胞的作用

目的 探讨Caspase-3基因表达对人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡诱导作用.方法 应用重组技术将重构型Caspase-3基凶亚克隆至带有报告基因的真核表达载体pEGFP中,脂质体介导转染人鼻咽癌细胞CNE2通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达:荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化;MTT法检测转染Caspase-3基因对CNE2细胞生长的影响.结果 RT-PCR方法证实重构型Caspase-3基因可在CNE2细胞内表达,形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征,结果表明Caspase-3对CNE2的细胞生长有抑制作用.结论 重构型Caspase-3对CNE2细胞的生长有抑制作用.     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的:观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法:采用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞(siRNA-eIF4E组),同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组及空质粒组比较,siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调(P<0.01),Hep-2细胞生存率下降(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

靶向survivin基因siRNA对喉癌细胞增殖、凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因的siRNA对喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响,为喉癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向survivin基因的siRNA转染至喉癌细胞株Hep-2;MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测对喉癌细胞Hep-2增殖的影响;RT-PCR检测喉癌细胞Hep-2survivin基因mRNA表达的变化;Western Blot检测survivin基因蛋白表达;流式细胞技术检测喉癌细胞Hep-2凋亡情况。结果各浓度survivin-siRNA转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组（〈0.05）,survivinmRNA和蛋白表达有不同程度减弱,并且有明显的浓度依赖性,随着浓度的上升表达率下降。结论利用RNA干扰技术沉默survivin基因表达可以显著抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,不同浓度survivin-siRNA转染能下调survivinmRNA和蛋白表达,靶向survivin基因的RNA干扰技术在喉癌的基因治疗中具有一定价值。     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的：观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法：采用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞（siRNA-eIF4E组）,同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果：与空白对照组及空质粒组比较, siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调（P<0.01）,Hep-2细胞生存率下降（P<0.05）,细胞线粒体膜电位降低（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）,凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调（P<0.05）。结论：siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

滑菇多糖对K562白血病细胞增殖的抑制及Caspase-3基因表达的影响

目的:研究滑菇多糖(PNP)的抗肿瘤作用及诱导K562细胞凋亡的机制.方法:采用MTT法检测PNP对K562细胞增殖的抑制作用;绘制生长曲线;Hochest 33258染色计算凋亡率;RT-PCR法、Western Blot方法检测凋亡相关基因Caspase-3的表达.结果:MTT分析表明,PNP作用48 h后可明显抑制K562细胞的增殖;Hochest染色结果显示,PNP能诱导K562细胞出现典型的凋亡形态,且凋亡率随多糖浓度增加而增大,经PNP 100,200,400 mg/L的处理后,凋亡率分别是对照组的3.15,6.55和8.62倍.PNP能诱导凋亡相关基因Caspase-3在mRNA水平上的表达;Western Blot显示PNP能诱导Caspase-3编码蛋白的表达,且随多糖浓度的增加表达量增加.结论:PNP对K562细胞增殖有抑制作用, 并能促进其凋亡;PNP通过诱导凋亡相关基因Caspase-3表达促进细胞凋亡.     

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（hIL-24）基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

降低端粒酶表达对人喉癌细胞系Hep-2生长的影晌

目的：用表达端粒酶反义RNA的方法研究端粒酶在喉癌细胞生长中的作用。方法：将端粒酶反义RNA真核表达载体，pBBS212-hTR转染入人喉癌Hep-2细胞系中，采用端粒重复扩增法测定端粒酶活性，用MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，并用电镜观察细胞生长状况。结果：端粒酶反义RNA表达后能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，抑制细胞增殖并促进其凋亡.结论：以端粒酶反义RNA降低端粒酶的方法对人喉癌细胞系Hep-2的生长有明显抑制作用。     

减毒沙门菌介导的TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的:利用沙门菌作为真核质粒携带载体,在体内外观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和鸡贫血病毒VP3基因对胃癌细胞的生长抑制作用.方法:将重组质粒pBud-TRAIL、pBud-VP3、pBud-TRAIL-VP3电转化减毒沙门菌SL7207,经稳定性鉴定后直接转杂胃癌细胞株SGC-7901,24 h后利用荧光显微镜观察有无融合绿色荧光蛋白表达,MTT法检测表达载体对胃癌细胞的生长作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期变化,并用免疫组织化学方法检测该载体对胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响.荷瘤小鼠口服携带重组质粒的减毒沙门菌,8周后通过RT-PCR检测肿瘤组织内真核载体的表达状况,并测量荷瘤瘤体大小.结果:重组质粒能够在减毒沙门菌中稳定存在,经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后能够较好的表达,转染48 h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有抑制作用,流式细胞仪观察到pBud-TRAIL-VP3能使胃癌细胞的凋亡率明显增高,TRAIL和VP3能够协同促进胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9的表达.体内实验提示pBud-TRAIL-VP3沙门菌载体能够在肿瘤组织中表达并能抑制肿瘤生长(P<0.05).结论:减毒沙门菌将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞后,体内外实验证实该载体对胃癌细胞的生长起明显抑制作用,TRAIL和VP3联合作用机制与促进Caspase-3、Caspase-9的表达有关.     

内皮抑素抑制喉鳞癌作用机制的初步探讨

目的 探讨内皮抑素对喉鳞癌细胞(Hep-2)的作用及其可能的机制.方法 ①MTT法检测不同浓度(10～50μg/ml)的内皮抑素作用72h和30μg/ml的内皮抑素作用不同时间(24～72h)对Hep-2细胞的影响;②电镜观察Hep-2细胞超微结构的变化;③RT-PCR法检测Hep-2细胞内皮抑素作用组中Survivin基因的表达.结果 ①MTT检测显示,内皮抑素(20～50μg/ml)能抑制Hep-2细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),具有剂量-时间依赖性;②电镜观察,Hep-2细胞内皮抑素作用组均出现凋亡改变;③RT-PCR结果,与正常Hep-2细胞对照组相比较药物作用组Survivin基因表达受到部分抑制,差异呈显著性(P＜0.01).结论 内皮抑素能抑制喉鳞癌Hep-2细胞,并具有时间-剂量依赖性,机制可能为诱导细胞凋亡.提示,内皮抑素可能通过诱导喉癌细胞本身的凋亡,对喉癌的生长与转移起到抑制作用.     

siRNA靶向慢病毒对人喉癌Hep-2细胞系FAK基因的沉默效应

目的探讨siRNA靶向慢病毒对人喉癌Hep-2细胞系FAK基因的沉默效应,以期探索喉鳞癌基因治疗的新途径。方法 Western Blot检测人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2中的FAK蛋白表达水平。用FAK-RNAi慢病毒转染Hep-2细胞,同时监测转染效率。半定量RT-PCR检测FAK基因被FAK-siRNA沉默后mRNA的表达水平。Western-blotting检测FAK基因被FAK-siRNA沉默后蛋白质的表达水平。采用荧光PI染色检测凋亡细胞数目,MTT法检测细胞体外增生能力。结果 Western blot结果显示Hep-2细胞中FAK的3个蛋白片段表达量较高。多次重复western blot检测转染前后Hep-2细胞的FAK基因蛋白表达发现,FAK-RNAi慢病毒对目的基因在Hep2细胞中具有显著knockdown作用。使用RT-PCR技术检测FAK-siRNA干扰Hep-2细胞系前后FAK mRNA的表达发现,FAK-RNAi慢病毒对目的基因,在mRNA水平有明显knockdown作用。PI染料染色后,可见FAK-RNAi组30%～35%的肿瘤细胞凋亡。MTT Assay结果显示,FAK-siRNA慢病毒转染Hep2细胞后,Hep2细胞活力明显下降。结论经用慢病毒载体介导的FAK-siRNA在喉鳞癌细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应。     

塞来昔布对喉癌Hep-2细胞COX-2和Caspase-3表达的影响

目的:探讨塞来昔布对喉癌细胞株Hep-2生长抑制及对环氧化酶-2(COX-2)和Caspase-3变化的影响。方法:将不同浓度塞来昔布作用于体外培养的人喉癌细胞株Hep-2,MTT法计算细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot检测COX-2表达,分光光度法检测Caspase-3活性。结果:塞来昔布呈剂量依赖性显著抑制Hep-2细胞生长,阻滞细胞G0/G1期转化,且可明显降低COX-2蛋白水平,增加Caspase-3活性。结论:塞来昔布能抑制喉癌细胞的生长,其机制可能与下调COX-2表达、增强Caspase-3活性有关。     

重组抗HER2 ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr-3细胞的促凋亡作用

目的:观察构建的重组抗HER2 ScFv /tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用. 方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游,转染SKBr-3细胞. 间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达,MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 结果:转染SKBr-3细胞后,检测出目的蛋白的表达. MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制. 间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达,并可观察到Cyt c在细胞质中存在, SKBr-3细胞出现凋亡. 结论:重组抗HER2 ScFv /tBid分子可以在转染的SKBr-3细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.     

腺病毒介导的hIL-24基因对肺腺癌细胞生长的影响

目的研究重组腺病毒Ad-hIL-24对A549肺癌细胞的影响。方法将载有hIL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad-hIL-24）感染A549肺癌细胞,RT-PCR法检测hIL-24基因的表达,光学显微镜及荧光显微镜下观察病毒感染前后细胞形态的变化,运用MTT法和流式细胞术（FCM）分别检测其对A549细胞的生长抑制及凋亡效应,通过免疫细胞化学分析caspase-3的变化。结果Ad-hIL-24感染A549细胞后有hIL-24目的基因的转录,可明显抑制A549细胞的生长,凋亡率明显增加,并能上调caspase-3的表达。结论腺病毒介导的hIL-24基因具有抑制A549肺癌细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达。结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达。结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

EGFR反义cDNA联合p16β干预喉癌细胞信号转导的实验研究

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA联合野生型p16β在体外对人喉癌Hep-2细胞信号转导的干预作用.方法 将已纯化的EGFR反义cDNA重组腺病毒和p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞,采用MTT实验、流式细胞术(FCM)、免疫组化、Western blot等方法检测Hep-2细胞增殖抑制作用;进行细胞周期、DNA含量、细胞凋亡率的定量分析;检测重组腺病毒对Hep-2细胞EGFR蛋白表达的抑制和p16β蛋白过表达.结果 反义EGFR mRNA表达重组腺病毒能有效抑制Hep-2细胞的增殖活性;超过77.7%以上的被转染Hep-2细胞被阻滞在G0/G1期;转染细胞的凋亡率升高;同时出现EGFR蛋白表达的抑制和p16β蛋白的过表达.当p16β重组腺病毒和EGFR反义cDNA重组腺病毒联合转染Hep-2细胞后其抑制Hep-2细胞增殖活性、细胞周期阻滞、抑制细胞调亡作用明细增强.结论 p16β和EGFR反义cDNA能有效地干预人喉癌Hep-2细胞的信号转导机制,从而达到抑制Hep-2细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用.     

野生型p53基因转染前列腺癌细胞系PC-3m对细胞凋亡的不同影响

目的：观察野生型p53基因转染对前列腺癌细胞PC-3m增殖和凋亡的影响。方法：用脂质体Lipofectamine将真核表达载体pCMV—p53和pCMV—p53mt135分别转染PC-3m细胞，MTT法检测转染前后细胞生长情况，转染48h后采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果：pCMV—p53转染后的PC-3m细胞生长明显受到抑制，FCM显示，转染48h后，细胞凋亡率为15％。结论：野生型p53基因瞬间转染PC-3m细胞可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。     

三氧化二砷和维生素C联合诱导喉癌细胞株Hep-2凋亡的作用

目的探讨VitC与三氧化二砷(As2O3)促喉癌细胞株Hep-2凋亡的协同效应。方法体外培养人喉癌细胞株Hep-2,以As2O3合用VitC孵育细胞,采用四甲基偶氮唑(MTT)法,Annexin-V/PI双染色流式细胞术来观察各组的细胞凋亡情况,并通过流式软件分析细胞周期变化。结果As2O3与VitC联用能显著降低单用As2O3的细胞存活率和升高细胞凋亡率(P<0.05),VitC能显著增强As2O3诱导细胞集中于G2/M期的作用,从而增强其促细胞凋亡作用。结论联用VitC能增强As2O3诱导细胞凋亡的作用,增强作用可能与影响细胞周期有关。     

靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达 对HepG2 肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG2 肝癌细胞体外增殖与凋亡的影响。 方法 利用基因重组技术构建PDCD5-Caspase-3 融合基因,克隆到带有EGFP 基因的GV358 慢病毒表达载 体,与辅助质粒共同转染293T 细胞,通过同源重组,获得融合基因重组慢病毒PDCD5-Caspase-3。体外 转染人肝癌HepG-2 细胞72 h 后,Western bolt 检测肝癌HepG-2 细胞中PDCD5 蛋白和Caspase-3 蛋白表 达,CCK-8 法检测PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG-2 肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术观察其 对细胞凋亡的影响。结果 PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达可增加HepG-2 肝癌细胞中PDCD5 蛋白和 Caspase-3 蛋白合成（P <0.05）;与对照组或空白组相比,转染72 h 后实验组细胞增殖能力下降（P <0.05）; 与对照组或空白组比较,转染72 h 后实验组细胞凋亡率增加（P <0.05）。结论 促凋亡基因PDCD5 和 Caspase-3 联合表达可抑制HepG2 肝癌细胞增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌治疗潜在靶点。     

亚砷酸对人喉癌Hep-2细胞RECK基因表达及去甲基化的影响

目的:探讨不同浓度亚砷酸对人喉癌Hep-2细胞中伴Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)基因表达及去甲基化的影响。方法:分别将0.5、1.0、2.0、4.0μmoL/L的亚砷酸作用于体外培养的Hep-2细胞24～72 h,MTT法计算细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,并用甲基特异性PCR检测RECK基因甲基化情况。RT-PCR和W estern b lot分别检测RECK mRNA和蛋白表达水平。结果:0.5～4.0μmoL/L亚砷酸能抑制Hep-2细胞增殖,使Hep-2细胞阻滞于S期和G2/M期;RECK基因甲基化水平随亚砷酸浓度增高而降低,非甲基化水平则逐渐增高;亚砷酸能增加RECK mRNA和蛋白表达。结论:亚砷酸能促进Hep-2细胞中RECK基因去甲基化并提高其表达水平,从而发挥抑制细胞增殖。