基因修饰后树突状细胞吲哚胺2，3二氧化酶表达变化及其对T细胞增殖的影响

背景：研究表明，吲哚胺2，3二氧化酶的表达可以降低机体的免疫应答反应，保护细胞和组织移植物，参与同种异体移植免疫耐受。细胞毒T细胞相关抗原4可以抑制T细胞的活化，在维持周边免疫耐受的过程中起着关键性的作用，但其作用机制尚不清楚。 目的：观察转染细胞毒T细胞相关抗原4基因前后树突状细胞上吲哚胺2，3二氧化酶表达水平及其活性对T淋巴细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2005-09/2007-02在华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室和眼科实验室完成。 材料：成年雌性Lewis大鼠和F344大鼠购自北京维通利华实验动物种子中心，体质量180~200 g。 方法：采用脂质体转染的方法将质粒pG/细胞毒T细胞相关抗原4转入F344大鼠髓源性树突状细胞中，将转染前、转然后24，48，72 h树突状细胞分为4组，反转录-聚合酶链反应检测转染前后骨髓源树突状细胞中吲哚胺2，3二氧化酶mRNA的表达，反相高效液相色谱法检测吲哚胺2，3二氧化酶活性。以Lewis大鼠T淋巴细胞为反应细胞，丝裂霉素C灭活的转染前后不同时间F344大鼠骨髓源树突状细胞为刺激细胞建立混合淋巴细胞培养体系。有或无L-色氨酸存在下，CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖率，AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡。 主要观察指标：①树突状细胞吲哚胺2，3二氧化酶mRNA的表达及吲哚胺2，3二氧化酶活性。②混合淋巴细胞培养CCK8及AnnexinV-FITC细胞凋亡检测结果。 结果：转染细胞毒T细胞相关抗原4后树突状细胞中吲哚胺2，3二氧化酶的表达较转染前高(P < 0.01)，且转染后48 h树突状细胞的吲哚胺2，3二氧化酶活性最高(P < 0.01)。高表达吲哚胺2，3二氧化酶的树突状细胞在体外能诱导同种异体T细胞凋亡，抑制T细胞增殖，混合淋巴细胞培养体系中加入L-色氨酸后T淋巴细胞的凋亡率明显下降(P < 0.01)。 结论：树突状细胞上的吲哚胺2，3二氧化酶表达水平与T淋巴细胞的增殖密切相关，树突状细胞在体外可能通过吲哚胺2，3二氧化酶活性发挥免疫抑制作用。     

耐受性树突状细胞体外培养的基本特征

背景：树突状细胞是体内最重要的抗原提呈细胞,在免疫调节中扮演着免疫应答和免疫耐受的双重角色,对维持机体的免疫平衡起重要作用。 目的：探讨耐受性树突状细胞的体外培养方法,观察不同培养条件下耐受性树突状细胞的基本特征。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象,随机分组设计,于2006-09/2008-02在南昌大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：8周龄的Balb/c纯系雄性小鼠,体质量20~25 g,用于分离和制备骨髓单个核细胞。 方法：将小鼠骨髓单个核细胞分为5组在不同的培养体系中进行体外诱导培养：空白对照组(不加任何因子)、树突状细胞组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4)、血管活性肠肽组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽)、地塞米松组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+地塞米松)、血管活性肠肽+地塞米松组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽+地塞米松)。 主要观察指标：光镜下动态观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c表达,四甲基偶氮唑盐法检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的活性,特异性夹心酶联免疫分析测定树突状细胞上清液中白细胞介素10、白细胞介素12的水平。 结果：①利用粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、血管活性肠肽、地塞米松、脂多糖等因子体外培养能生成具有典型树枝状突起的树突状细胞。②树突状细胞组、血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组CD11c的表达高于空白对照组(P < 0.05)。血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组CD40、CD80和CD86表达,淋巴细胞增殖活性及培养上清液白细胞介素12水平均低于树突状细胞组(P < 0.05),血管活性肠肽组以质量浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L减低明显,其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最低,差异具有显著性意义(P < 0.05)。③血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组细胞培养上清液中白细胞介素10水平均高于树突状细胞组(P < 0.05),血管活性肠肽组以质量浓度为40 μg/L,地塞米松组以10 μg/L升高明显,其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最高,差异具有显著性意义(P < 0.05)。 结论：①小鼠骨髓单个核细胞体外经粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管活性肠肽或/和地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成致耐受性树突状细胞。②与常规诱导培养树突状细胞方法比较,耐受性树突状细胞具有CD40、CD80、CD86表达低,刺激淋巴细胞增殖弱的特点;耐受性树突状细胞培养体系上清液白细胞介素10水平高而白细胞介素12水平低。③粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管活性肠肽+地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成耐受性树突状细胞效果较佳,其中以血管活性肠肽40 μg/L、地塞米松10 μg/L的培养条件为最好。     

热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗的制备与鉴定

目的 制备热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗,探讨其增强树突状细胞抗原递呈、诱导细胞毒性T淋巴细胞产生更强肿瘤细胞杀伤作用的机制.方法 采用改良Inaba法,在重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)作用下,体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,电子显微镜和流式细胞术检测其生物学特征;分别以不同加热温度处理U251细胞,制备凋亡U251细胞致敏树突状细胞疫苗,3H-TdR掺入法和MTT法检测T淋巴细胞增殖能力和活化细胞毒性T淋巴细胞杀伤率.结果 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,小鼠骨髓来源细胞体外培养6～7 d即可诱导出树突状细胞,经倒置相差显微镜和电子显微镜证实细胞表面呈典型树突状结构;流式细胞术检测证实其表达特异性表面标记物CD11c,同时表达功能相关性抗原CD80、CD86和MHCⅡ.倒置相差显微镜和流式细胞术确定热诱导U251细胞凋亡的最佳条件为:44℃处理3 h再常规培养12 h,凋亡U251细胞可更好地负载树突状细胞,负载的树突状细胞可以激发T淋巴细胞增殖,诱导活化细胞毒性T淋巴细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力.结论 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,经体外成功制备的小鼠骨髓来源的树突状细胞,可热诱导凋亡胶质瘤细胞敏敏树突状细胞疫苗于体外有效激发T淋巴细胞增殖,诱导细胞毒性T淋巴细胞产生较强的杀伤肿瘤细胞能力.     

小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存

树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能,成为肿瘤抗原的良好载体。获得大量的树突状细胞,对于肿瘤疫苗的研制具有重要作用。 目的：对小鼠骨髓树突状细胞进行诱导、培养、扩增及冻存,并对比冻存后复苏细胞与未冻存细胞的细胞特性,寻找一种能够大量获得树突状细胞及有效储存的方法。 方法：取小鼠骨髓细胞,在含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(10 μg/L)和重组小鼠白细胞介素4(5 μg/L)的完全培养基中对其进行诱导、培养及扩增。培养第6天,对培养获得的树突状细胞在加有冷冻保护剂DMSO的完全培养液中冻存。复苏后,在培养基中加入脂多糖、对细胞诱导,获得大量的成熟树突状细胞,最终获得的树突状细胞与未进行冻存的细胞在细胞活力、形态学、细胞表型、混合淋巴细胞反应等方面对比。 结果与结论：复苏后,(82.2±4.73)%细胞存活,存活的细胞经脂多糖诱导后发育为成熟树突状细胞,在形态学、细胞表型及混合淋巴细胞反应等方面与未经冻存的树突状细胞差异无显著性意义。提示小鼠骨髓源性树突状细胞冻存复苏后,细胞生物学特性与未冻存的细胞无明显差别,用冻存的方法储存树突状细胞,能够避免在不同时期应用细胞时反复进行培养,可以获得大量的同质细胞。     

未成熟树突状细胞表面CD1d分子在体外移植免疫中的作用☆

背景：树突状细胞具有双向免疫调节作用,成熟树突状细胞激活免疫应答,而未成熟树突状细胞则倾向诱导免疫耐受。 目的：探讨鼠CD1d分子在未成熟树突状细胞诱导移植免疫耐受中的作用,以及在此过程中细胞因子的参与机制。 方法：利用vIL-10转染的BALB/c小鼠未成熟树突状细胞在体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因、脂多糖刺激成熟,经抗CD1d(anti-CD1d)干预。观察培养后的细胞表型、细胞因子表达。为探明CD1d分子在异体T细胞存在下的免疫作用,进行不同实验条件的初次、再次混合淋巴细胞培养(1stMLC、2ndMLC),观察T细胞增殖、细胞因子表达。 结果与结论：Anti-CD1d的干预降低了未成熟树突状细胞增殖异体T细胞的能力,anti-CD1d干预的未成熟树突状细胞致敏异体T细胞后其免疫功能低下;anti-CD1d干预在异体T细胞存在时影响未成熟树突状细胞在功能上的成熟,主要表现在抑制白细胞介素12的分泌,加强白细胞介素10的分泌。     

霍乱毒素B亚单位对树突状细胞成熟的影响

背景：已有实验证明,霍乱毒素可诱导树突状细胞成熟。霍乱毒素B为霍乱毒素的无毒亚单位,是一种良好的免疫佐剂和输送抗原载体,其是否能促进树突状细胞成熟至今尚未得到证实。 目的：观察树突状细胞2.4的表型和功能变化,初步探讨霍乱毒素B对树突状细胞成熟的影响。 方法：通过细胞培养增殖树突状细胞2.4。将树突状细胞分成5组：空白对照组：不进行任何处理;霍乱毒素B 0.1,1.0,10 mg/L组：分别在培养液中加入相应霍乱毒素B;阳性对照组：培养液中加入脂多糖,终浓度1 mg/L。每组设6复孔。采用流式细胞术检测培养不同时间树突状细胞2.4细胞表面CD80,CD86,MHC-Ⅱ类分子的表达,并行体外混合淋巴细胞反应,MTT法观察树突状细胞对同种T细胞的刺激能力。 结果与结论：10 mg/L霍乱毒素B显著增强树突状细胞表面分子(CD80,CD86和MHC-Ⅱ)的表达(P < 0.01),并显著提高树突状细胞对T细胞的激活能力(P < 0.01)。阳性对照组与空白组之间差异有显著性意义(P < 0.01)。结果显示霍乱毒素B能增强树突状细胞的活化与成熟,对其免疫学功能起正性调节作用。     

系统性红斑狼疮患者血清IFN-α和IL-6的共同作用对造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响

背景：系统性红斑狼疮与树突状细胞的功能活化密切相关。在体内,树突状细胞来源于造血干细胞,其分化成熟的过程受多种因素的影响。系统性红斑狼疮患者血清中存在细胞因子网络失调,以往研究多关注于单一因子的参与作用。 目的：课题创新性提出和观察系统性红斑狼疮患者血清α干扰素和白细胞介素6共同作用下对CD34+造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响。 设计、时间及地点：分组对比观察,完全随机细胞学体外实验,于2006-05/2008-10在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成。 材料：外周血标本取自50例就诊于南京医科大学第一附属医院风湿免疫科的系统性红斑狼疮患者,以及30例南京医科大学的健康志愿献血者。15份脐血标本取自南京医科大学附属南京妇幼保健院健康足月顺产的新生儿,产妇及其家属均对实验知情同意。 方法：无菌采集系统性红斑狼疮患者和正常对照者的外周静脉血,根据正常人血清中α干扰素、白细胞介素6的浓度,采用百分位数法求得血清α干扰素、白细胞介素6浓度的95%参考值范围,并以浓度超过此范围为异常升高。取新生儿脐血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,免疫磁珠法纯化CD34+造血干细胞,并诱导其定向分化为树突状细胞。在培养过程中设立6组,分别加入：正常对照血清、α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和白细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合α干扰素及白细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清,各组血清体积分数均为10%,培养14 d。 主要观察指标：流式细胞仪检测树突状细胞的表型,ELISA法检测树突状细胞分泌细胞因子的水平,混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力,及其对T细胞亚群分化率影响。 结果：①与正常血清对照比较,α干扰素、白细胞介素6及二者同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清诱导培养的树突状细胞其HLA-DR,CD80,CD86的表达均明显升高(P < 0.05),分泌白细胞介素12 的水平均明显降低(P < 0.05),刺激T细胞增殖能力均明显增强(P < 0.05)。混合α干扰素及白细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清诱导培养的树突状细胞上述各项指标均恢复至正常血清对照水平。②与正常血清对照比较,白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血清其CD3+CD8−IFN-γ+、CD3+CD8+IFN-γ+细胞亚群百分率明显下降(P < 0.05);α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和白细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清其CD3+CD8−IFN-γ+和CD3+CD8+IFN-γ+细胞亚群百分率均明显升高(P < 0.05)。 结论：系统性红斑狼疮血清α干扰素和白细胞介素6的共同作用对CD34+造血干细胞定向分化为树突状细胞产生了异常影响,可促进树突状细胞的表型成熟和功能活化,并间接影响T细胞亚群的分化,可能参与系统性红斑狼疮的发病。     

小鼠骨髓树突状细胞的培养扩增及生物学特性分析

背景：树突状细胞是目前已知功能最强的专职性抗原递呈细胞，但树突状细胞在体内分布广泛且数量较少，获得大量的树突状细胞是研究树突状细胞特性和功能的前提。 目的：建立小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法，观察其形态和相关特征。 设计、时间及地点：树突状细胞形态学观察实验，于2006-08/2007-05在中山大学中山眼科中心实验室完成。 材料：健康雌性C57BL/6小鼠。 方法：在无菌条件下提取C57BL/6鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4协同诱导下培养，加用磷酸脂多糖刺激，分成磷酸酯多糖-树突状细胞和单纯树突状细胞组，前者在培养加入磷酸酯多糖，后者不加。 主要观察指标：应用光镜和电镜下观察树突状细胞的形态，流色细胞仪检测鉴定其生物学特征。 结果：体外培养2 周后具有典型的树突状细胞形态，光镜下显示细胞表面不规则，呈树突状突起，电镜下可见培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征，流式细胞鉴定为髓系树突状细胞，高表达MHC II类分子及共刺激分子(MHC II，CD80，CD83，CD11 c)。单纯树突状细胞组的细胞中度表达MHCⅡ类分子，低水平表达共刺激分子，刺激T细胞增殖的能力较弱；磷酸酯多糖-树突状细胞组细胞高水平表达MHCII类分子和共刺激分子。 结论：实验所采用的树突状细胞体外原代培养的方法能在体外培养出大量的未成熟树突状细胞，具有典型树突状细胞的形态特征及较高的纯度。     

不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞

背景：体内成熟和不成熟树突状细胞(dendritic cells, DC)数量极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%~0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖。 目的：以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成。 材料：雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验。 方法：采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20 µg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5 µg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC。 主要观察指标：以流式细胞仪分析DC表型。混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力。ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平。 结果：随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降。CD86、MHC-II表达阳性率随培养时间延长逐渐增加。培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强(P < 0.01)。培养7 d以后,DC上清液中白细胞介素12水平明显增高(P < 0.01),脂多糖刺激以后升高更加明显(P < 0.01)。脂多糖刺激后DC表型MHCII、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强。 结论：5 µg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9 d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC。 关键词：     

TGF—β1基因转染对未成熟树突状细胞表型和功能的影响

目的探讨转化生长因子（TGF）-β1基因转染对未成熟树突状细胞（imDC）细胞表型和功能的影响。方法分别从Wistar大鼠骨髓培养imDC及成熟树突状细胞（mDC），用TGF-β1-pcDNA3质粒转染imDC，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞术检测其细胞表型，ELISA法检测IL-10、IL-12、TGF-β1水平，观察其对脂多糖（LPS）刺激的反应，混合淋巴细胞反应比较其在体外刺激抗原特异性T淋巴细胞增殖的能力。结果TGF-β1-imDC在LPS刺激后仍能保持未成熟的细胞形态，表面抗原CD86，CD80，CD40及MHC Ⅱ表达都有明显下降（P〈0．01），分泌TGF-β-1水平为（793．82±206．38）ng／L，明显高于imDC和mDC（P〈0．01），分泌IL-10、IL-12明显低于mDC（P〈0．01），而与imDC无显著差异（P〉0．05），LPS刺激TGF-β1-imDC 24h后分泌IL-10、IL-12的能力显著低于imDC（P〈0．01），在体外刺激抗原特异性T淋巴细胞增殖的能力明显低于imDC和mDC（P〈0．01）。结论TGF-β1-imDC的表面抗原表达明显下降，抗原递呈能力降低，分泌免疫抑制因子增加，能够维持细胞于未成熟状态。