U937巨噬细胞对SW872脂肪细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨U937巨噬细胞与SW872脂肪细胞混合培养状态下对脂肪细胞增殖及凋亡的影响,及巨噬细胞在脂肪细胞胰岛素抵抗形成中的意义.方法 以SW872前脂肪细胞,0.6、1.2 mmol/L油酸诱导分化成熟SW872脂肪细胞为研究对象,分别与U937巨噬细胞混合培养,采用酶联免疫吸附法测定各组混合培养前后TNF-α、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)分泌水平的变化,应用四甲基偶氮唑盐比色法检测对前脂肪细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测各组脂肪细胞在不同炎性反应状态下对细胞凋亡的影响.采用配对t检验对数据进行分析处理.结果 随着油酸诱导水平的增加及SW872前脂肪细胞分化成熟,TNF-α、MCP-1分泌水平均明显升高,脂肪细胞凋亡率亦逐渐增加(Pa<0.05);在与U937巨噬细胞混合培养后,TNF-α、MCP-1分泌水平进一步升高,但炎性反应状态改变对各脂肪细胞组混合培养前后的凋亡率无明显影响(Pa>0.05);U937巨噬细胞的混合培养对SW872前脂肪细胞的增殖率有明显抑制作用(P<0.05).结论 油酸诱导SW872前脂肪细胞成熟分化,在高脂负荷下,炎性反应因子分泌水平急剧升高,同时脂肪细胞凋亡率增加.炎性反应负荷改变对脂肪细胞凋亡率无明显影响.巨噬细胞的趋化加重了其炎性反应状态,并抑制了前脂肪细胞的增殖.     

小分子干扰技术缄默Survivin基因表达对Jurkat细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的研究应用短发夹RNA(shRNA)技术缄默Survivin基因表达后对白血病细胞株Jurkat细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法构建shRNA-Survivin重组质粒,电击转染至Jurkat细胞,G418筛选得到稳定表达重组质粒的细胞系,反转录(RT)-PCR检测转染细胞中Survivin mRNA表达水平变化,化疗药物长春新碱(VCR)及柔红霉素(DNR)分别作用各转染组细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞的增殖抑制率,流式细胞术测定药物对各组细胞的凋亡效应。结果 DNA测序证实表达质粒构建成功,RT-PCR检测结果显示重组质粒能明显抑制Jurkat细胞Survivin mRNA表达,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。VCR及DNR作用转染细胞后,可有效抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论 Survivin基因对Jurkat细胞生长有重要作用,转染shRNA-Survivin表达质粒能有效抑制细胞Survivin mRNA表达,缄默Survivin基因表达的细胞对化疗药物的敏感性显著增高。     

Survivin与癌基因相互作用对儿童白血病细胞凋亡的影响

Survivin是一种新近发现的凋亡抑制蛋白,通过抑制Caspase-3、7活性而抑制细胞凋亡,还参与细胞周期调控。Sur-vivin选择性的在肿瘤组织表达而在正常成熟组织不表达,其与肿瘤发生、发展有关,并可能是导致肿瘤细胞耐药的因素,是肿瘤靶向治疗的一个很好的靶基因。     

阿糖胞苷与地塞米松联合诱导Jurkat细胞凋亡的协同效应

目的 探讨阿糖胞苷(Ara-C)协同地塞米松(DEX)诱导糖皮质激素(GC)抵抗人类T淋巴细胞ALL细胞凋亡的效应及其临床意义.方法 将不同水平的Ara-C(30 nmol·L-1、100 nmol·L-1、300 nmol·L-1)分别与不同浓度的DEX (100 μmol·L-1、500 μmol·L-1)联用对GC抵抗型Jurkat细胞进行不同浓度联合药物暴露.通过流式细胞计数检测各组细胞24 h、48 h暴露后凋亡率;ELISA法检测暴露24 h后核因子-κB(NF-κB)p65亚基活性;反转录-PCR(RT-PCR)和Western blot法检测暴露24 h后Survivin表达和蛋白水平.结果 Ara-C(100 nmol·L-1、300 nmol·L-1)与DEX(100 μmol·L-1、500 μmol·L-1)联合暴露组,其24 h和 48 h 暴露后细胞凋亡率均显著高于同浓度DEX单药暴露组(Pa<0.001),且呈显著浓度依耐性;联合暴露组NF-κB p65活性和Survivin转录水平及蛋白水平较同浓度DEX单药暴露组均有显著下降(Pa<0.05).结论 Ara-C与DEX具有显著的浓度依赖协同诱导GC抵抗型Jurkat细胞凋亡的作用,且这种协同效应可能是由于二者对NF-κB活性及其下游Survivin表达的协同抑制所产生的.     

Survivin在白血病中表达及其与CasPase、Fas相关性研究

目的　研究Survivin在白血病中表达的临床意义及其在白血病细胞凋亡中的作用。方法　应用蛋白印迹法检测1 8例白血病患者和 1 0例正常对照组患儿外周血中单个核细胞Survivin的表达 ;采用免疫组化法测定Fas和Caspase表达 ;运用四格表的确切概率法进行Survivin表达与白血病患者临床特点和Fas、Caspase表达的进行相关性分析。结果　 1 .白血病患者1 8例中 1 3例Survivin表达阳性 (72 .2 % ) ,正常对照组 1 0例Survivin检测均为阴性。Survivin表达在不同白血病类型、WBC组间有显著差异 (P <0 .0 5)。 2 .白血病患者 1 8例中 ,9例Fas表达阳性。经统计学分析 ,Survivin表达与Fas表达无相关性(P =0 .1 1 6)。 3 .白血病患者 1 8例中 5例Caspase 3表达阳性 ,两者比较 (P =0 .0 0 2 ) ,有显著性差异。结论　Survivin基因可选择性的在白血病患者外周血单个核细胞中表达 ,而在对照组中无Survivin表达 ,表明Survivin表达与白血病的发生有一定关系。Survivin表达情况可能成为白血病临床诊断、预后判断的有效指标。Survivin的作用位点可能不在Fas水平 ,而主要通过抑制Caspase 3表达 ,在凋亡途径的下游发挥抗凋亡作用。     

Pax2、增殖细胞核抗原、细胞凋亡在肾病综合征激素耐药中的作用

目的观察原发性肾病综合征（PNS）激素敏感与激素耐药组患儿Pax2、增殖细胞核抗原（PCNA）表达及细胞有效凋亡率，探讨Pax2在肾脏檐皮质激素（GC）耐药中的作用。方法采用免疫组织化学法观察PNS患儿40例肾活检组织Pax2、PCNA表达，采用荧光显微镜检测细胞凋亡。结果激素敏感组Pax2适量表达，与PCNA阳性表达呈正相关,激素耐药组，Pax2呈过度表达，与PCNA阳性表达无明显相关性。Pax2始终与细胞凋亡旱负相关。结论Pax2适量表达，通过促进细胞增殖及抑制凋亡，修复受损的小管-间质。Pax2过度表达，细胞增殖与凋亡进一步减少，导致肾小管病理改变加重，使其对激素不敏感共至耐药。     

生存素蛋白和增殖细胞核抗原在自然杀伤/T细胞淋巴瘤中的表达及其关系

目的探讨凋亡抑制基因Survivin和增殖细胞核抗原(PCNA)在自然杀伤(NK)/T细胞淋巴瘤中的表达及其关系。方法NK/T细胞淋巴瘤标本25例,经过组织学形态及CD45RO、CD3ε、CD20免疫组织化学分析,免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化酶连接法(SP法)检测T细胞内抗原(TIA-1)、粒酶B,原位杂交法检测EB病毒编码的mRNA(EBER 1/2),按照2000年WHO新的淋巴瘤分类方法明确诊断。应用SP法检测25例NK/T细胞淋巴瘤组织和10例反应性增生淋巴组织中的Survivin和PCNA表达水平,分别计数1 000个肿瘤细胞中Survivin及PCNA阳性细胞所占百分比,作为Survivin阳性率及细胞增殖指数(PI)。结果25例NK/T细胞淋巴瘤组织中Survivin表达阳性17例(68.0%),10例反应性增生淋巴组织中Survivin不表达,其差异有统计学意义(P<0.01);25例NK/T细胞淋巴瘤PI为(41.48±5.10)%,10例反应性增生淋巴组织PI为(20.10±2.77)%,二者比较差异有统计学意义(t=12.39,P<0.01);Survivin表达阳性组PI为(43...     

盐酸吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及bcr/abl mRNA表达的影响

目的 观察盐酸吉西他滨对K562细胞增殖、凋亡及bcr/abl基因表达的影响,探讨盐酸吉西他滨用于慢性粒细胞白血病急变期治疗的可行性. 方法 采用水溶性四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测盐酸吉西他滨对K562细胞增殖的影响,采用凋亡的原位酶标记检测(TUNEL)法检测盐酸吉西他滨对K562细胞凋亡的影响,采用半定量RT-PCR技术检测盐酸吉西他滨作用于K562细胞后bcr/abl融合基因mRNA表达变化. 结果 0.1 mg/L、1.0 mg/L 、10.0 mg/L盐酸吉西他滨分别作用K562细胞12 h、24 h、48 h、72 h 后,K562细胞增殖受到抑制,抑制作用随质量浓度及时间增加而增强,但48 h和72 h比较无显著性差异,10.0 mg/L吉西他滨组作用K562细胞48 h抑制率达(29.3±0.008)%.吉西他滨组对K562细胞的抑制作用明显强于同质量浓度同时间的阿糖胞苷组,二者比较有显著性差异(P<0.01).TUNEL实验结果 显示10.0 mg/L吉西他滨作用于K562细胞48 h,凋亡率为15.3%,明显高于阿糖胞苷组 3.7%(P<0.05)和空白对照组2.0%(P<0.05).RT-PCR结果 显示10 mg/L吉西他滨作用48 h对K562细胞bcr/abl融合基因mRNA的表达有明显抑制作用,与同剂量阿糖胞苷组比较无显著性差异.结论 盐酸吉西他滨对K562细胞有一定的增殖抑制及促凋亡作用,且具有剂量和时间依赖性.10 mg/L吉西他滨能够明显下调慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因mRNA表达,有望联合应用于慢性粒细胞白血病急变期的治疗.     

幼年类风湿关节炎活动期血清对树突状细胞细胞周期、凋亡及脾淋巴细胞增殖的影响

目的探讨幼年类风湿关节炎(JRA)活动期血清对树突状细胞(DC)细胞周期、凋亡及脾淋巴细胞增殖的影响,以便进一步探讨DC在JRA发病机制中的作用。方法分离来源于正常小鼠的骨髓细胞,体外用细胞因子(IL-4,GM-CSF)诱导、分化为DC,脂多糖(LPS)刺激获取成熟DC;常规法获取同种异体脾淋巴细胞。光镜观察DC形态改变、流式细胞术对其进行鉴定。利用流式细胞仪分析JRA活动期血清辅助DC成熟过程对DC细胞周期、凋亡产生的影响MTT法检测其对淋巴细胞增殖的影响。结果JRA血清组与正常血清组比较,DC G1期细胞数减少、S G2/M期细胞数显著增多(P<0.05)。DC凋亡细胞数有下降趋势。JRA血清能明显促进淋巴细胞增殖(P<0.05),成熟DC培养液与JRA血清共同作用时上述增殖作用更显著(P<0.01)。结论JRA活动期血清能促进DC和淋巴细胞增殖,同时可能抑制DC凋亡。JRA的发生可能与DC细胞周期、凋亡的调节以及DC介导的免疫放大机制有关。     

靶向C区的小发卡RNA体外对耐药乙型肝炎病毒的抑制作用

目的 评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段.方法 从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1;根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3.经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体.中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞.分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组.在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达;应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化.结果 构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出.Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,在转染后第3天对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(83.53±0.48)％、(86.12±0.83)％.定量PCR检测显示特异性siRNA可以显著抑制HBV-DNA,可以使DNA拷贝数降低102个数量级.结论 基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2细胞中耐药HBV的复制和表达.该特异性siRNA可作为耐拉米夫定HBV的一种有效的基因治疗措施.     

短发卡结构状RNA体外抑制呼吸道合胞病毒M2基因 mRNA水平和病毒蛋白表达的研究

目的观察针对人类呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因mRNA构建的短发卡结构状RNA重组质粒在细胞水平对RSV复制的影响,为利用RNA干扰技术抑制RSV感染的研究奠定基础。方法将已成功构建的重组质粒pshRNA7816/8330转染HEp-2细胞,通过显微镜观察pshRNA7816/8330对RSV感染细胞病变(CPE)的抑制效率,利用四甲基偶氮唑盐比色实验检测pshRNA7816/8330的细胞毒性,经RT-PCR方法检测pshRNA7816对RSVM2mRNA表达的影响,免疫细胞化学染色法检测pshRNA7816对细胞内RSV蛋白的影响。结果pshRNA7816/8330对HEp-2细胞的正常生长没有明显的细胞毒性作用,2个重组质粒均能抑制RSV所致的CPE,但pshRNA7816对CPE抑制作用较pshRNA8330要强,RT-PCR和免疫细胞化学染色法结果显示pshRNA7816能明显降低RSVM2基因mRNA和RSV蛋白表达水平。结论针对RSVM2-1基因所构建的短发卡结构状RNA重组质粒pshRNA7816在细胞水平能有效抑制RSV的CPE形成降低RSVM2mRNA和病毒蛋白表达水平,从而干扰RSV的复制。