体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤的修复

目的探讨体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤治疗的可行性。方法①体外分离、培养、扩增骨髓基质干细胞,诱导分化培养为软骨样细胞;②以胶原膜为支架在体外构建组织工程软骨;③建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只,对照组8只,实验组8只;应用组织工程软骨修复兔股骨头关节软骨缺损,8、16周后观察修复效果。结果8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充,组织切片显示缺损处有新生软骨形成,阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达;16周后关节软骨缺损仍为软骨样组织修复,部分见表面粗糙,镜下见软骨细胞排列紊乱。结论体外构建的组织工程软骨可用于修复兔股骨头关节软骨缺损,较长期的观察结果显示有退变倾向。     

HA作为药物载体合成HA-TGF-β1缓释剂对自体兔耳软骨移植影响的实验研究

目的研究HA作为药物载体合成HA-TGF-β1缓释剂对软骨组织中软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原的表达和GAG分泌含量的影响。方法将32只家兔随机分成2周组、4周组、8周组和12周组4个组别,每组8只。每只兔取耳软骨1cm×1cm4块,分别植入自体背部4个皮下腔,按既定顺序给予腔内注射NS2mL、HA（100μg/L）2mL、TGF-β1（10ng/mL）2mL及TGF-β1（10ng/mL）＋HA（100μg/L）混合液2mL,于移植后不同时期用HE染色观察软骨细胞的增殖与退变及边缘细胞的活力,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达及阿利新蓝比色法测定细胞外基质糖胺多糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量。结果在本实验条件下,软骨移植后,HA-TGF-β1组软骨细胞的增殖活跃,Ⅱ型胶原的表达呈强阳性,GAG的含量显著高于其他组（P〈0.05）,差异有统计学意义。结论 HA对TGF-β1有一定的缓释作用,使其缓慢释放,诱导软骨细胞的增殖,增加细胞的活力,从而使移植软骨更易成活。     

体外培养时间对兔间充质干细胞软骨形成的影响

目的　探讨生长因子(bFGF,TGF -β1)诱导下,培养时间对兔间充质干细胞(MSCs)体外软骨形成的影响。方法　取兔 MSCs 梯度离心,分离培养。取 P3、P5、P7、P10 代细胞,在 bFGF、TGF- β1 各20 ng/ml诱导下培养。观察细胞生长形态变化,用甲苯胺蓝染色观察细胞蛋白多糖的分泌。RT- PCR半定量检测Ⅱ型胶原mRNA的相对表达量,取关节软骨细胞作阳性对照。结果　各代细胞形态无明显差异。MSCs甲苯胺蓝染色呈异染性,RT- PCR检测Ⅱ型胶原阳性表达,各代细胞灰度值,P3 0 .16±0 .05,P5 0 .37±0. 03,P7 0 .88±0 .08,P10 0. 47±0. 05,软骨细胞 2 08±0 13。P7代细胞灰度值达最大(P<0 .01),软骨细胞是 MSCs的 3 倍以上。结论　生长因子能维持 MSCs细胞活性,促进生长繁殖。一定培养时间内,软骨生成能力渐增强,但随时间进一步延长,软骨分化减弱。     

肝细胞生长因子对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的　观察腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA(adHGF)转染兔骨髓基质细胞 (MSC)后的主要生物学特性。方法　抽取成年雄性新西兰白兔骨髓 ,密度梯度离心获得MSC。取兔膝关节软骨 ,体外培养软骨细胞至第 3代。adHGF转染第 5代MSC ,噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增生活力 ,阿尔新蓝法检测细胞培养上清液中氨基己糖多糖 (GAG)含量。酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测adHGF转染MSC后HGF的表达。免疫组织化学染色及反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结果　原代MSC为短梭形、簇状生长 ,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长。adHGF转染前后细胞增生状态差异无显著性。MSC转染后GAG含量增加。免疫组织化学染色MSC转染前后I型胶原阳性 ,转染后Ⅱ型胶原弱阳性。转染后HGF表达量在转染 1周内最高 ,达 12 0 5ng/ml,并可持续至 6周。RT PCR表明MSC在adHGF转染前后均表达I型胶原 ,转染后微量表达Ⅱ型胶原。结论　MSC在体外培养过程中的自然转归是趋向于成骨。MSC不仅是HGF的源细胞 ,而且可作为靶细胞接受外源目的基因的转染并有效表达     

壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种支架体外构建组织工程软骨的比较研究

目的 观察兔关节软骨细胞在壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚羟基乙酸(PGA)三种细胞支架上的生长情况,探讨更适合构建工程软骨的细胞支架材料.方法 多聚赖氨酸包埋壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种多孔海绵支架.将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于三种支架上.体外培养4周,对组织工程软骨进行大体标本观察和HE染色,检测软骨内DNA含量、Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的分泌量.结果 软骨细胞在壳聚糖支架内生长良好,培养4周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌Ⅱ型胶原和GAG的能力较其他两种支架好(P＜0.01).结论 壳聚糖支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架.     

BMP2/β-TCP-HA复合支架体内构建组织工程软骨的实验研究

目的 探讨以骨形态发生蛋白2(BMP2)/β磷酸三钙-透明质酸(β-TCP-HA)复合支架在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性.方法 分别构建BMP2/β-TCP-HA(实验组),BMP2/β-TCP(对照组)及β-TCP(空白组)支架.分离培养大鼠间质干细胞(MSCs)至三代,利用负压吸引将MSCs作为种子细胞分别接种于各组支架内,并植于裸鼠皮下.于术后12周观察其成软骨效果并对修复组织行大体,组织学及免疫组化观察.结果 术后12周实验组支架降解基本完全,能形成丰富的软骨组织,软骨细胞外基质丰富,糖胺多精(GAG)及Ⅱ型胶原免疫组化染色均旱强阳性;对照组支架大部降解,支架内形成岛状软骨增生;GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性;空白组支架部分降解,以纤维组织和脂肪组织为主;仅在支架边缘见少最软骨组织,GAG及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阴性.结论 BMP2/β-TCP-HA复合支架为MSCs提供了一条可能有效的关节软骨修复途径,是目前软骨组织工程较为理想的细胞支架材料.     

Sox6基因和Col2a1在大鼠bMSCs体外成软骨分化中表达及其意义

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)成软骨分化中Sox6基因和Ⅱ型胶原α1(Col2α1)表达水平的变化及其意义.方法 2个月龄SD大鼠分离bMSCs,置含15％胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基中培养.传至第3代后,细胞分为诱导组和未诱导组,诱导组在培养基中添加含转化生长因子β1(TGF-β1)的诱导剂,分别在诱导后3、6、12、24 h、3、7和14d提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR法检测Sox6基因和Col2α1基因的表达.同时应用细胞免疫化学法检测诱导14d的Col2α1的表达.结果 与未诱导组细胞比较,bMSCs在TGF-β1的诱导下,形态上发生软骨样细胞变化;诱导后6h,Sox6基因的表达上升6.3倍(P＜0.01),随后迅速下降,3-14 d维持在4.0-4.7倍水平;Col2α1基因的表达量在诱导后3d达1.9倍,7d和14d分别达14.3和35.8倍(P＜0.01).诱导组可见大量Ⅱ型胶原阳性细胞.结论 bMSCs在体外可以分化为软骨样细胞,Sox6基因在bMSCs的成软骨分化的早期和晚期都发挥了一定的作用.     

采用纤维蛋白凝胶种植技术体外构建组织工程软骨

目的 探讨有效体外构建高质量组织工程软骨的细胞种植技术.方法 将分离、培养的兔第1代软骨细胞分别通过纤维蛋白凝胶种植技术(实验组)及常规种植方法(对照组)接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架.体外培养3周后收获组织工程软骨,行大体观察,组织切片,定量检测氨基糖胺聚糖(GAG)、DNA含量及Ⅱ型胶原染色面积.结果 实验组较对照组构建的组织工程软骨体积更大、更有弹性和光泽;其Ⅱ型胶原染色面积、GAG、DNA含量均高于对照组(P＜0.05).结论 与传统种植方法比较,采用纤维蛋白凝胶种植技术能在体外形成更高质量的组织工程软骨.     

骨形态发生蛋白-13促进小鼠骨髓干细胞的软骨分化

目的:研究骨形态发生蛋白-13对小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化过程的作用。方法:体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,用骨形态发生蛋白-13溶液干预培养1,4,7,14 d取样检测。倒置相差显微镜观察细胞形态;RT-PCR,western-blot和免疫细胞化学法检测不同时期Ⅱ型胶原,SOX9,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。结果:Ⅱ型胶原和SOX9之mRNA和蛋白的表达在第4天开始出现并不断升高;Alcian染色结果显示骨形态发生蛋白-13诱导细胞分泌蛋白多糖基质,可见细胞小结区域呈明显的异染性。结论:骨形态发生蛋白-13可以定向诱导小鼠骨髓干细胞的软骨分化。     

转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的可能性。方法取SD大鼠骨髓间质干细胞,流式细胞仪检测两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29、CD45、CD34、CD24的表达。将增殖至第三代的BMSCs分为对照、TGF-β1、GDF-5、TGF-β1+GDF-5四组,分别以含不同细胞因子诱导液培养14d后,采用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29表达阳性;CD45、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14d后,TGF-β1、GDF-5、TGF-β1与GDF-5三组的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平较对照组均有明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。联合诱导组经过诱导后的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平明显高于TGF-β1组及GDF-5组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 GDF-5与TGF-β1都具有诱导BMSCs向类髓核细胞分化的能力,且二者之间具有协同作用,联合应用可以更好的诱导BMSCs向类髓核细胞分化。     

Neocartilage formation from predifferentiated human adipose derived stem cells in vivo

AIM: To examine the chondrogenic potential of human adipose derived stem cells (hASC) induced by human transforming growth factor beta2 (hTGF beta2) in vitro, and to investigate if predifferentiated hASC can produce neocartilage in vivo. METHODS: hASC were isolated from subcutaneous adipose tissue and cultured in pellets with the addition of hTGF beta2. Chondrogenic differentiation was assayed by RT-PCR, Western blotting, toluidine blue staining, and immunohistochemistry staining for collagen type II. For the in vivo study, intact induced cell pellets or the released cells embedded in alginate gel with different concentrations were implanted subcutaneously in nude mice. Specimens were harvested at different time points and carried with histological and immunohistochemistry examination to evaluate the cartilage formation. RESULTS: RT-PCR analysis revealed that hASC produced aggrecan and collagen type II after 7 d of induction and continued throughout the culture period. This was also demonstrated by the Western blot analysis, positive staining of toluidine blue, and immunohistochemistry for collagen type II. After reseeding in the monolayer, the cells isolated from the pellets displayed a polygonal morphology compared with the primary spindle shape. hASC were released from the induced cell pellets when embedded in alginate gel (implanted cell concentration=5X10(6) /mL or higher). They produced neocartilage after 12 weeks in vivo culture; however, intact induced cell pellets implanted subcutaneously rapidly lost their differentiated phenotype. CONCLUSION: Chondrogenesis of hASC in vitro can be induced by combining pellet culture and hTGF beta2 treatment. Predifferentiated hASC embedded in alginate gel have the ability of producing neocartilage in vivo.     

神经生长因子(NGF)对兔角膜缘干细胞增殖的影响

目的:探讨神经生长因子(NGF)对兔角膜缘干细胞增殖作用的影响及最佳有效浓度。方法:取成年大耳白兔角膜缘组织,应用组织块消化培养法进行原代培养,取第2代生长状态良好的干细胞,以5×103个/m l细胞浓度接种于96孔细胞培养板中,依次加入不同浓度的NGF,培养48h后,采用M TT法测定细胞增殖情况。结果:10ng/m l、50ng/m l、100ng/m l、200ng/m l不同浓度组的NGF均有促进角膜缘干细胞的增殖作用,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。1ng/m l组与对照组、50ng/m l组与200ng/m l组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:NGF可有效促进培养角膜缘干细胞的生长,培养的适宜浓度为10~100 ng/m l,为角膜缘干细胞移植患者术后及角膜外伤或溃疡时局部应用NGF提供了理论依据。     

Comparison of ganglioside expression between human adipose- and dental pulp-derived stem cell differentiation into osteoblasts

Human adipose-derived stem cells (hADSCs) and dental pulp-derived stem cells (hDPSCs) have been considered alternative sources of adult stem cells because of their potential to trans-differentiate into multiple cell lineages. This study investigated the possible role of gangliosides in the osteoblast differentiation of hADSCs and hDPSCs. First, we investigated characterization of hADSCs and hDPSCs using FACS analysis. Mesenchymal stem cell specific markers, CD44 and CD105, were expressed but not hematopoetic markers, CD45 and CD117 in both of hADSCs and hDPSCs. High-performance thin-layer chromatography analysis showed that increased gangliosides were associated with differentiation of hADSCs and hDPSCs into osteoblasts. RT-PCR analysis confirmed that osteoblast specific genes, ALP, BMP-2, collagen were expressed in differentiated osteoblasts, however, the another osteoblast specific gene, osteocalcin, was not expressed. When hADSCs and hDPSCs were cultured under osteoblast-differentiation conditions, alkaline phosphatase (ALP) activity was increased in comparison to hADSCs and hDPSCs. Furthermore, specifically both ALP activity and ganglioside expression increased more in hDPSCs-derived osteoblasts than hADSCs-derived osteoblasts. These results suggest that gangliosides play a more important role in regulating the osteoblast-differentiation of hDPSCs compared to hADSCs.     

黄芪甲苷对脂肪源性干细胞体外生物学行为的影响

目的探讨黄芪甲苷(Astragaloside IV,Ast)对体外培养人脂肪源性间充质干细胞(human adipose-derived mesen-chymal stem cells,hADSCs)生物学行为的影响。方法应用CCK8和PCNA法检测不同浓度和时间Ast孵育对hADSCs增殖情况的影响,选取出Ast最适干预条件并对hADSCs进行培养,观察药物干预后细胞形态、表面标志物、成骨及成脂分化潜能。结果 CCK8和PCNA结果均显示,Ast 20 mg.L-1干预48 h后细胞增殖最为明显,进一步选取Ast20 mg.L-1干预hADSCs 48 h,与对照组相比,两组细胞CD29、CD44、CD105的阳性率均为96%-99%;两组细胞成骨诱导与成脂诱导结果也无差异。结论 Ast可促进ADSCs增殖,以20 mg.L-1、孵育48 h为最适干预条件,且该条件干预后并不影响hADSCs细胞形态,表面标志物水平及多向分化能力。     

Feridex标记胎盘来源的间充质干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的分离胎盘组织来源的间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞,以期找到能成功标记神经干细胞的方法。方法将胎盘组织剪碎后消化、培养,加入神经干细胞诱导因子10ng/mL表皮生长因子（EGF）＋10ng/mL重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）＋DMEM/F12,并分别添加相应浓度的血清,预诱导3d后加入DMEM/F12＋0.1μmol/L全反式维甲酸（RA）,10ng/mL胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）＋10ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）进行正式诱导7d。结果诱导10d后用Feridex标记诱导后的细胞,普鲁士蓝染色显示90%以上的干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,Nestin染色显示阳性。结论胎盘来源的间充质干细胞能成功诱导为神经干细胞,且Feridex可成功标记诱导后的细胞。     

体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为平滑肌细胞的实验研究

目的体外培养成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs),并应用血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导ADMSCs分化为平滑肌细胞。方法采用酶消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs,流式细胞仪对第5代细胞进行表面抗原和细胞周期的检测,然后对第5代细胞进行PDGF-BB诱导,于诱导后2周进行免疫组织化学鉴定。结果体外培养的ADMSCs呈梭形,细胞形态均一,传代稳定。干细胞相关标志CD29,CD44表达阳性,内皮细胞相关标志CD31和造血干细胞相关标志CD34表达阴性。ADMSCs中G0/G1,S,G2/M期的细胞分别占90.14%,3.77%,6.09%。定向诱导后倒置显微镜下观察细胞呈长梭状,胞膜清晰,无空泡,可重叠生长,融合后细胞形成"峰"和"谷"状,免疫荧光化学显示诱导组细胞α平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可经PDGF-BB诱导分化为平滑肌细胞。     

胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析

目的 通过原代软骨细胞的体外培养和鉴定,探讨胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的可行性.方法 分离出兔鼻中隔软骨组织,用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法进行消化,获取原代软骨细胞.使用倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长情况,并用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色进行表型鉴定.结果 软骨细胞原代培养形成单层细胞需要7～8d,传代培养时间约2～3 d,细胞以圆形或类上皮细胞形态为主,甲苯胺蓝染色证实细胞可特异性合成糖胺聚糖,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色可证实细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原.结论 本研究成功建立了简单易行的胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养大量纯净的软骨细胞,提高了消化速率,加大了细胞释放率,为组织工程气管软骨种子细胞的获取提供重要的技术支撑.     

菊苣酸对大鼠软骨关节炎的作用及机制

目的: 探究菊苣酸(cichoric acid)对大鼠软骨关节炎的作用及机制。方法: 分离大鼠膝关节处软骨原代细胞,利用白细胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α)诱导软骨关节炎细胞模型,给予低中高剂量的菊苣酸和姜黄素干预。免疫荧光分析Type Ⅱ collagen表达水平,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色观察干预后软骨关节炎细胞变化,β-半乳糖苷酶染色进行衰老检测,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测FOXO4 (forkhead box O4)、p53 (tumor protein P53)和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平,生化检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD),丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量。结果: 分离得到大鼠软骨原代细胞,IL-1β和TNF-α诱导细胞炎性,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色面积增加,大鼠软骨关节炎细胞构建成功。与模型组相比菊苣酸高剂量组,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、β-半乳糖苷酶染色和TUNEL染色平均光密度比值,MDA含量、NO含量,FOXO4和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),p53蛋白表达水平,SOD含量显著增加(P＜0.05)。结论: 菊苣酸阻止软骨关节炎导致的细胞衰老,抑制软骨关节炎导致的细胞凋亡,进而阻止原代细胞中软骨关节炎的进展,其机制与菊苣酸下调FOXO4蛋白参与的衰老进程相关。     

葡萄糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

目的：目前小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESC）常规应用高浓度葡萄糖（25mmol／L）培养基培养,但是在应用干细胞向糖尿病胰岛beta细胞分化的研究中发现,慢性高糖培养可促进干细胞的凋亡、降低细胞分化的效率及分化后胰岛beta细胞对葡萄糖的反应性,因此本研究拟选择合适的较低浓度的葡萄糖以优化胚胎干细胞的培养基、提高胚胎干细胞的生长、分化效率。方法：mESC传代4或12h后,将传统的25mmol／L葡萄糖培养基分别换为5、10、15、25mmol／L葡萄糖培养基培养,均用碱性磷酸酶（AP）染色计数细胞集落形成情况、台盼兰染色测定细胞数目,MTT法测定细胞活力及用4’,6-联脒-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色检测细胞凋亡情况。结果：mESC传代4h后即调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成明显减少。（2）各葡萄糖浓度组与25mmol／L组相比,mESC增殖及细胞活力均受到不同程度明显影响。mESC传代12h后调换葡萄糖浓度：（1）各葡萄糖浓度组（5、10、15mmol／L）与25mmol／L组相比,集落形成无明显变化,且AP染色呈强阳性。（2）15mmol／L葡萄糖组对mESC增殖及细胞活力均无明显影响。（3）15mmol／L葡萄糖组与25mmol／L葡萄糖组细胞核形态正常,均未见明显凋亡。结论：ESC传代12h后将培养基中传统的高糖（25mmol／L）降低为15mmol／L,不影响mESC细胞活力及多能分化潜能和未分化状态。