心肌梗死后残存心肌细胞肥大性改变及其IGF-1、IGF-1R的表达

目的观察心肌梗死后残存心肌细胞肥大性改变及其胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的表达,探讨梗死心肌心肌细胞肥大的机制。方法取急性心肌梗死后2周、4周、8周的梗死心肌,制备单心肌细胞悬液,采用激光共聚焦扫描显微镜(Confocal)检测心肌细胞体积,采用免疫组织化学法检测心肌细胞IGF-1、IGF-1R的表达。结果急性心肌梗死8周梗死区域心肌细胞体积较正常区域心肌细胞增大(37563.93±6176.79μm3vs.28638.61±6890.89μm3,t=4.840,P=0.020),细胞肥大以宽度和厚度为主;梗死区域心肌细胞可见IGF-1染色阳性颗粒,IGF-1表达高于正常区域心肌细胞(79.58±4.57vs.64.12±3.91,t=27.564,P=0.002);IGF-1R主要分布于心肌细胞膜,梗死区域心肌细胞IGF-1R表达高于正常区域心肌细胞(67.02±2.56vs.66.73±3.49,t=3.845,P=0.042),其中以急性心肌梗死4周IGF-1R表达最高。结论心肌梗死后残存心肌细胞分泌IGF-1和IGF-1R,并可能在促使残存心肌细胞肥大中起了积极作用。     

肝细胞生长因子对人肾小管上皮细胞转分化抑制作用初步研究

目的：晚近研究提示肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF)具有减轻实验性肾间质纤维化的作用，但其机制尚不十分清楚；本研究目的在于探讨HGF对人肾小管上皮细胞（HKC）转分化的作用。方法：将体外培养的HKC细胞分为：（1）无血清培养对照组；（2）阳性对照组（MCP－1＋AAⅠ）；（3）HGF组（HGF浓度为0.01,0.1,1.0,10.0ng/ml);(4)MCP-1 AAⅠ HGF组（HGF浓度0.1,1.0,10.0ng/ml)。应用间接免疫荧光法检测HKC细胞内α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白、角蛋白表达的变化。应用流式细胞技术检测α-SMA（＋）的HKC细胞百分数。结果：不同浓度HGF分别作用于HKC细胞48h后，经间接免疫荧光法测定该组HKC细胞角蛋白、波形蛋白及α－SMA抗原表达,与无血清对照组均无显著差异；流式细胞术测得HGF组α-SMA表达阳性HKC细胞百分数，与无血清对照组（平均为3.1%)也无显著差异（P＞0.05)。MCP－1＋AAⅠ培养HKC48h后α－SMA（＋）的HKC细胞平均百分数为85.6%。MCP－1＋AAⅠ＋HGF（0.1,1.0,10.0ng/ml)培养HKC48h后，α－SMA（＋）的HKC细胞百分数分别为26.7%，2.0%,13.6%，比阳性对照组明显下降（P＜0.05)。结论：（1）HGF对正常HKC细胞分化无明显影响；（2）HGF对某些因素诱导下发生的增强的HKC细胞转化可能具有显著抑制作用。     

粒细胞集落刺激因子联合携带肝细胞生长因子基因的BMSCs移植对心肌梗死大鼠血管重建的影响

目的研究粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)联合携带肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的BMSCs移植对心肌梗死大鼠血管重建的影响,初步探讨作用机制。方法取3周龄雄性SD大鼠骨髓分离培养BMSCs,取第3代BMSCs以携带HGF基因的5型复制缺陷型腺病毒(Ad-HGF)感染。成年雄性SD大鼠44只,体重200～250 g,结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型。造模4周后心脏超声检查,以左室短轴缩短率(shorting fraction,FS)<30%作为造模成功标准。取其中12只大鼠,于梗死心肌边缘注射0.1 mL Ad-HGF感染的BMSCs(5×107个/mL),2、7、14 d后用Western blot方法检测大鼠体内HGF蛋白的表达。将其余32只大鼠随机分为4组,每组8只:对照组注射0.1 mL生理盐水;G-CSF组注射0.1 mL生理盐水并于腹腔注射G-CSF 100μg(/kg.d)共5 d;HGF组注射0.1 mL Ad-HGF感染的BMSCs(5×107个/mL);联合治疗组注射0.1 mL Ad-HGF感染的BMSCs(5×107个/mL)并于腹腔注射G-CSF 100μg/(kg.d)共5 d。细胞移植后2周,行心功能和血流动力学检测,然后处死大鼠取心肌组织行免疫荧光双染后激光共聚焦显微镜下评价血管生成情况,Western blot检测VEGF蛋白表达。结果感染Ad-HGF的BMSCs移植2、7 d时在大鼠体内表达HGF蛋白。心功能及血流动力学检测显示,G-CSF组左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末期压力(left ventricularend-diastolic pressure,LVEDP)、LVSP上升/降低时间(dP/dtmax)、FS与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05);HGF组和联合治疗组与对照组相比,LVEDP显著降低,LVSP、FS和dP/dtmax显著升高(P<0.05);与HGF组相比,联合治疗组的FS和dP/dtmax升高(P<0.05)。免疫荧光双染显示心肌梗死交界区增生细胞是血管内皮细胞。联合治疗组血管密度明显高于其他3组(P<0.05),VEGF蛋白表达较其他3组明显增加(P<0.05)。结论 在大鼠心肌梗死4周时给予G-CSF联合携带HGF基因的BMSCs移植治疗,可明显改善心功能,促进心肌梗死边缘缺血区域的血管生成,其作用机制之一是增加了缺血心肌VEGF蛋白的表达。     

胰岛素样生长因子1对缺氧复氧诱导的HK-2细胞损伤作用

目的探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）对缺氧复氧损伤人肾近曲小管上皮细胞株HK-2的凋亡影响及其作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞分为正常对照组（A组）、缺氧复氧损伤模型组（B组）、提前IGF-1干预组（C组）、即时IGF-1干预组（D组）、迟后IGF-1干预组（E组）5组。3个IGF-1干预组在不同时间给予IGF-1干预,复氧培养24h后,MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞凋亡,细胞免疫组织化学法检测Bcl—2阳性表达变化,Real-time PCR检测Bcl-2 mRNA表达水平变化。结果与A组相比,B组细胞增殖活性明显降低（P〈0．05）,细胞凋亡率明显升高（P〈0．05）,Bcl-2蛋白与Bcl-2 mRNA表达明显降低（P〈0．05）;与B组比较,IGF-1干预后,细胞增殖活性有所升高,以C组升高最明显（P〈0．01）,细胞凋亡率显著下降（P〈0．05）,又以C组下降最明显（P〈0.01）;Eel-2mRNA和其蛋白表达量均增高（P〈0．05）,以C组表达量增高最明显（P〈0.01）。结论IGF-1能够抑制缺氧复氧损伤HK-2细胞凋亡,可能与其上调Bcl—2蛋白表达有关。     

低频微动后转化生长因子β_1与胰岛素样生长因子在新骨组织中的表达研究

目的研究转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)与胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF-)在低频微动引起骨折间接愈合过程中的表达与意义。方法山东雌性高腿绵羊15只,行双侧胫骨中段横形截骨,形成2mm骨缺损,用带有微动装置的单边外固定支架固定。术后10d,随机选择一侧肢体为微动组,以频率1Hz,幅度0.25mm(30min/d)微动,4周结束;另一侧后肢不微动,为对照组。术后3、4和6周分别处死5只动物,应用免疫组织化学与RT-PCR检测骨痂组织中TGF-β1与IGF-的表达。结果免疫组织化学:术后3周,微动组TGF-β1在骨痂边缘的新生软骨细胞各区均有阳性表达,以增殖区最为显著;IGF-主要表达于软骨内骨化带边缘的成骨细胞,钙化并转化为新骨的软骨细胞与骨细胞中。对照组的相应区域,TGF-β1有少量表达,IGF-几乎无表达。4周,微动组新骨组织逐渐成熟,TGF-β1表达强度减弱,阳性信号主要位于细胞外基质与骨化带周围成骨细胞中;IGF-的表达趋于高峰,主要集中在新骨表面的成骨细胞、趋于成熟的骨细胞及趋于钙化的类骨质。对照组TGF-β1与IGF-仅有少量表达。6周,微动组TGF-β1的表达显著衰退,IGF-仍有适量表达,主要在新生骨小梁骨细胞中。对照组TGF-β1与IGF-仅有微量表达。微动组术后3、4周TGF-β1,3、4、6周IGF-吸光度(A)值与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR电泳示:术后3、4周,微动组骨痂中TGF-β1与IGF-的mRNA有较高的表达量;对照组骨痂中TGF-β1、IGF-的mRNA有轻度表达。术后6周,微动组TGF-β1、IGF-的mRNA表达量显著降低,但仍略高于对照组。微动组术后3、4周TGF-β1,3、4、6周IGF-A值与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低频微动在骨折愈合早期,可以促进TGF-β1与IGF-的表达。它们协同调节软骨内骨化的进程;后期主要由IGF-调节骨细胞的分化与类骨质的矿化,其可能更多的参与调节微动各个时期的细胞生物行为。     

胰岛素样生长因子1基因转染肌源性干细胞及表达

目的检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）转染肌源性干细胞效果及IGF-1基因表达情况。方法取失神经骨骼肌，分离、接种培养肌源性干细胞。取第3代细胞，用Lipofectamine介导，将重组质粒PAD—CMV—IGF-1转染肌源性干细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，酶联免疫吸附试验检测培养上清液中IGF-1的浓度变化，Westernblot及实时荧光定量RT-PCR检测细胞内IGF-1及其mRNA的表达，流式细胞仪检测细胞周期。结果在转染2周内细胞表达绿色荧光蛋白。转染后上清液中分泌IGF-1浓度上升，72h达到高峰为（32．2±5．3）ng／ml，后其浓度逐渐下降。Westernblot证实有与IGF-1大小相符条带出现。实时荧光定量RT—PCR证实mRNA表达明显增高，第3天达到高峰。流式细胞检测表明转染后肌源性干细胞S期比例增加。结论PAD—CMV—IGF-1质粒可有效转染肌源性干细胞。     

人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的进一步研究

目的：探索骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向肝细胞诱导的最有效方法,并对诱导后的细胞进行鉴定。方法：取健康成人的适量骨髓,采用梯度密度离心法分离BM-MSCs并行贴壁培养,扩增至第3代,取第3代细胞分3组分别进行诱导。A组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（EGF）;B组：肝细胞生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（FGF）;C组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（HGF）。分别进行培养,诱导前通过流式细胞仪分析细胞表面标志CD44、CD90的表达率对培养的BM-MSCs进行鉴定,诱导后通过RT-PCR、免疫组织化学法、糖原染色检测鉴定其诱导分化情况。结果：本文通过建立从人骨髓中分离、培养、扩增、传代、纯化BM-MSCs,定向诱导分化,使其成功向肝样细胞转化,图像分析表明C组鼠抗人白蛋白单克隆抗体（ALB）表达最为明显。结论：证明3种组合均可成功将骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化,均能分泌肝细胞特异性标记如鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体（AFP）、ALB、糖原,其中C组效果最为突出。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MsCs)定向分化为心肌细胞的可行性，建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MsCs；用5-氮杂胞苷(0．1、1、5、10、50和100μmol/L)定向诱导24h，分别在诱导培养的第14d和21d，检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs，移植于急性梗死心肌组织内，4周后进行组织学和免疫组织化学染色，并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导，培养21d后，5和10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白，并一些细胞自发性跳动；细胞移植4周后，在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。结论MsCs可以分化成心肌细胞。     

由胚胎干细胞分化的心肌细胞移植对心肌梗死大鼠左心室重构及心功能的影响

目的探讨小鼠胚胎干细胞（ES）分化的心肌细胞移植对SD大鼠心肌梗死后左心室重构及心功能的影响。方法采用悬滴-悬浮培养法诱导ES分化形成拟胚体。其中包含有大量心肌细胞。将雄性SD大鼠冠状动脉左前降支结扎。制成急性心肌梗死模型。1周后再次开胸。实验组于梗死区域注入心肌细胞悬液150μl（含细胞5×10^5个），梗死对照组于梗死区域注入等体积细胞培养液，另设假手术组，不结扎冠状动脉。心肌梗死后1周和细胞移植后4周，采用超声心动图评价大鼠左心室形态和功能，用免疫荧光技术检测移植细胞的存活及其表型。结果免疫荧光技术检测到分化的心肌细胞表达特异性转录因子α辅肌动蛋白、α肌球蛋白重链和肌钙蛋白1；逆转录聚合酶链反应检测到有心肌特异性转录因子Nkx-2．5、GATA-4及α肌球蛋白重链基因的表达；膜片钳记录显示所得到的分化的心肌细胞包括窦房结样起搏细胞、心房样细胞和心室样细胞。细胞移植后4周。与梗死对照组相比，实验组左心室收缩末期容积和舒张末期容积均显著缩小，左心室前壁舒张末期厚度明显增加（P〈0．01）。左室长轴缩短率显著升高（P〈0．01）。心脏组织冰冻切片可见4,6-联脒-2-苯基吲哚标记的呈蓝色荧光的移植细胞核。移植细胞表达肌钙蛋白I，移植细胞与受者的心肌细胞间有连接蛋白-43的表达。实验组中有2只（12．5％。2／16）出现了心脏畸胎瘤。结论由胚胎干细胞分化的心肌细胞移植可逆转心肌梗死大鼠左心室重构。改善左心室功能。     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）联合成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF4）诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）向肝细胞方向分化的能力。方法分别用HGF、FGF4、HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞。在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白（albumin，ALB）的表达；RT—PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果HMSCs经诱导向肝样细胞转化。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达；各诱导组RT—PCR均可检测出AFP和ALBmRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论HGF、FGF4、HGF＋FGF4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高。     

负载胰岛素样生长因子-1的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物修复大鼠骨缺损的实验研究

背景：目前已有较多研究表明将种子细胞复合于支架材料进行骨缺损的修复能够取得良好的效果,但仍需探索有效的生长因子以促进修复过程。 目的：探讨负载胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor,IGF-1）的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物对大鼠骨缺损的修复作用。 方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志物;将骨髓间充质干细胞进行成骨诱导后检测碱性磷酸酶的活性以鉴定其成骨能力;IGF-1过表达载体转染骨髓间充质干细胞并筛选稳转细胞系,Real-time PCR以及Western blot鉴定稳转细胞系中IGF-1的表达。扩培细胞,并与壳聚糖-胶原进行复合培养。同时建立大鼠骨缺损模型,造模成功后将20只大鼠随机分为4组,每组5只。实验组植入负载IGF-1的骨髓间充质干细胞复合支架,支架修复组植入未经细胞复合的支架,干细胞复合支架修复组植入单纯骨髓间充质干细胞复合支架,空白对照组缺损处未植入任何物质。术后分别通过X射线和组织学切片观察比较各组大鼠的骨缺损修复情况。 结果：流式细胞术鉴定结果显示细胞CD44阳性率为98.19%,CD45阳性率为3.65%,CD90阳性率为97.62%。成骨诱导后碱性磷酸酶浓度升高至（11.57±0.48）U/L,显著高于未经成骨诱导的细胞（5.55±0.63）U/L（〈0.05）。Real-time PCR以及Western blot检测结果IGF-1稳定转染的细胞中IGF-1 mRNA以及蛋白的表达均显著升高（〈0.05）。X射线以及组织学观察结果表明空白组骨缺损不能自行修复,壳聚糖-胶原支架与骨髓间充质干细胞复合物植入大鼠后未见明显的免疫排斥反应,与其他组相比负载IGF-1的骨髓间充质干细胞与壳聚糖-胶原复合物组的成骨及修复效果均较为明显。 结论：骨髓间充质干细胞是较为理想的骨组织工程种子细胞,将IGF-1负载于骨髓间充质干细胞能够促进骨组织的修复。     

银杏叶提取物对实验性糖尿病大鼠肾组织HGF/c-met表达的影响

目的：研究银杏叶提取物（ginkgo biloba extract,EGb）对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用及其可能机制。方法：SD大鼠随机分为糖尿病对照组（DC）、银杏叶提取物（金纳多）治疗组（DG）和正常对照组（NC）,观察各组大鼠肾脏病理改变;应用免疫组化监测HGF、TGF-β1表达量,运用RT-PCR监测HGF、c-met的mRNA表达情况。结果：免疫组化显示：HGF在NC组微量表达于肾小球系膜区,DC组第2周表达明显增加,与NC组相比差异有统计学意义（P〈0.01）,第6周表达较前明显下降;DG组第2周表达明显增加,第6周表达较前有所下降,与NC组同期相比差异有统计学意义（P〈0.01）,与DC组相比差异有统计学意义（P〈0.05）;TGF-β1在NC组中无阳性表达,DC组表达明显升高,与NC组同期相比差异有统计学意义（P〈0.01）,DG组表达升高,但低于DC组（P〈0.01）,与NC组同期相比差异有统计学意义（P〈0.01）;RT-PCR结果显示：HGF/c-metmRNA在NC组中有一定量表达,第2周与第6周之间差异无统计学意义（P〉0.05）;DC组与NC组相比,在第2周表达量升高（P〈0.01）,第6周表达量较前明显下降;DG组与DC组平行相比表达量显著升高（P〈0.01）。结论：HGF在DN的病程进展中发挥着重要作用,EGb可以抑制ACE,下调TGF-β1的表达,上调HGF/c-met的表达,减轻肾小球系膜区增生,改善肾功能。     

IGF-1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的观察胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)对猪软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量的影响。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106/ml于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入IGF-110ng/ml,每周传代1次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌GAG的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果体外培养的软骨细胞传代后合成GAG基质,第二代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入IGF-1能明显增强传代软骨细胞合成GAG的能力。结论IGF-1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成GAG基质。     

不同体外诱导时间对BMSCS成软骨分化的组织学特性影响的研究

目的探索体外不同时间的成软骨诱导,对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的组织学特性的影响。方法以猪第2代BMSCs为种子细胞,以聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)为支架,体外构建直径12 mm,厚3 mm的圆盘状复合物,联合应用TGF-β1(10 ng/mL)、IGF-I(50 ng/mL)及地塞米松(40 ng/mL),体外分别诱导1周和4周,并以未经诱导的BMSCs和软骨细胞为对照,分析和比较不同诱导时间对BMSCs体外成软骨分化的影响。结果体外诱导4周的BMSCs-PGA/PLA复合物的组织学结构明显较只诱导1周的致密,软骨特异性基质(如蛋白多糖、Ⅱ型胶原等)表达水平明显高于诱导1周的。结论体外诱导时间对BMSCs软骨定向分化具有重要影响,延长诱导时间可明显促进复合物成熟并增加其软骨基质分泌。     

HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响

目的观察HGF／Met通路对肝癌细胞株MHCC97-H干细胞样表型的影响,探讨其可能的作用机制。方法体外培养肝癌细胞株Huh7和MHCC97-H,采用细胞免疫荧光染色技术筛选高表达Met的肝癌细胞株MHCC97-H,将其分为4组：空白组（不做处理）、HGF刺激组（50μg/L HGF）、抑制组（50μg／LHGF＋1mol／LHGF抑制剂PHA665752）和表皮生长因子（EGF）／成纤维细胞生长因子（FGF）刺激组（50μg/LHGF＋20μg/LEGF＋20μg/LFGF）。Westernblot检测前3组MHCC97-H细胞中Met和磷酸化Met（p-Met）蛋白的表达。培养24h后光镜下观察前3组细胞形态学变化。克隆球形成实验检测4组细胞克隆球形成能力。荧光实时定量PCR检测空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）MHCC97-H细胞中多能干细胞相关基因表达变化。计量资料采用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析,两两比较采用LSD—t检验。结果细胞免疫荧光染色检测结果显示：肝癌细胞株MHCC97-H与Huh7细胞比较．前者高表达Met,将其作为后续研究对象。Westernblot检测结果显示：空白组、HGF刺激组和抑制组细胞中Met蛋白的相对表达量分别为0．44±0．04、0．37±0．03和0．41±0．04,3组比较,差异无统计学意义（F=2．31,P〉0．05）。而3组细胞中p-Met蛋白的相对表达量分别为0．020±0．010、0．070±0．020和0．010±0．000,3组比较,差异有统计学意义（F=34．11,P〈0．05）,其中HGF刺激组p-Met蛋白的表达水平高于空白组和抑制组（t=3．87,5．20,P〈0．05）。HGF刺激组MHCC97-H细胞形态呈现长梭状问质样改变,而抑制组和空白组细胞形态相似,呈上皮样。克隆球形成实验结果表明：空白组、HGF刺激组、抑制组和EGF／FGF刺激组克隆球数目分别为0、（35．0±6．3）个、（4．3±1．5）个和（54．3±2．5）个,4组比较,差异有统计学意义（F：511．28,P〈0．05）,其中HGF刺激组克隆球数目多于空白组和抑制组（t=9．62,8．21,P〈0．05）,而少于EGF／FGF刺激组（t=4．93,P〈0．05）。实时定量PCR检测结果显示：空白组和HGF刺激组不同时间点（2、4、8、16、24h）C—myemRNA相对表达量分别为1．00±0．11、1．68±0．09、1．08±0．24、1．18±0．13、0．78±0．14、1．06±0．04;Klf4mRNA分另1为1．00±0．20、1．43±0．16、0．87±0．28、1．19±0．29、2．17±0．43、1．41±0．06;Oct4mRNA分别为1．00±0．12、0．54±0．12、0．69±0．19、1．08±0．12、1．62±0．30、0．97±0．11,空白组和HGF刺激组不同时间点上述各指标比较,差异均有统计学意义（F=13．64,8．52,13．56,P〈0．05）;HGF刺激组2hc—myemRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．68倍（t=8．29,P〈0．05）,HGF刺激组16hK]f4mttNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了2．17倍（t=4．27,P〈0．05）,HGF刺激组16hOct4mRNA相对表达量达到峰值,与空白组比较,约升高了1．62倍（t=3．32,P〈0．05）。结论HGF／Met通路的活化能够诱导肝癌细胞MHCC97-H的干细胞样表型转化,其可能作用机制是通过增加多能干细胞相关基因的表达而实现的。     

抗纤灵二号方对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化的调节作用

目的：通过研究中药复方——抗纤灵二号方对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠肾间质α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1,TGF-β1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）表达的影响,探讨其对肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT）的调节机制。方法：建立大鼠UUO模型,90只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、代文组,及抗纤灵二号方低、中、高剂量组,于造模4周后腹主动脉采血检测血清肌酐（serum creatinine,Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）,收集24h尿液检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG）、β2-微球蛋白（β2-mi-croglobulin,β2-MG）,取梗阻侧肾组织,HE、Masson染色观察肾小管间质病变,免疫组织化学染色观察α-SMA、TGF-β1及HGF在肾间质的阳性染色表达,免疫印迹法检测肾组织α-SMA的蛋白表达,并进行半定量分析。结果：与假手术组相比,模型组大鼠Scr、BUN、尿NAG、β2-MG水平以及α-SMA、TGF-β1阳性表达显著升高（P〈0.01）。与模型组相比,抗纤灵二号方高剂量组大鼠Scr、BUN水平降低,尿NAG、β2-MG排泄减少（P〈0.01）;抗纤灵二号方高剂量组和代文组α-SMA、TGF-β1阳性表达显著下调,而HGF阳性表达则显著上调（P〈0.01）,α-SMA蛋白表达也明显下调（P〈0.05）;低、中、高三个剂量组的疗效呈剂量依赖关系。结论：抗纤灵二号方可能通过改善肾小球、肾小管功能,抑制α-SMA、TGF-β1的表达,诱导HGF的高表达,从而抑制肾小管EMT,达到改善肾间质纤维化的作用。     

骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘中营养和分化效应的变化

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植在椎间盘退变修复过程中营养效应与类髓核分化效应的变化.方法 用针吸髓核法建立兔的椎间盘退变模型,采取体外细胞培养技术,培养MSCs,并用含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒转染使之携带有GFP,在造成退变模型2周后以5×106个细胞/ml的浓度植入手术节段的椎间盘内.1、2、4、8周末用间接免疫荧光双标结合激光共聚焦显微镜观测MSCs表达的转化生长因子(TGF)-β1、胰岛素样生长因子(IGF)-1和低氧诱导因子(HIF)-1α、Ⅱ型胶原等在不同时间点上的表达及定量分析.结果 MSCs表达的TGF-β1、IGF-1在2周左右达到高峰,分别为(22.68±6.83)%、(35.67±6.56)%,之后开始降低;HIF-1α、Ⅱ型胶原在8周中均呈上升趋势,8周最高,分别为(55.35±14.06)%、(37.23±9.53)%,2～4周过程中上升最明显.结论 早期(2周时)MSCs以发挥营养效应为主,后期(4周后)以发挥类髓核分化效应为主.     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

肝细胞生长因子及其受体c—Met表达与结直肠癌同时性肝转移的相关性研究

目的探讨肝细胞生长因子及其受体c-Met（HGF-cMet）的表达与结直肠癌同时性肝转移的关系。方法2001年6月至2010年6月间有30例结直肠癌同性性肝转移患者在山东省肿瘤医院接受原发癌和肝转移癌一期根治性切除术,根据其是否伴有区域淋巴结转移分为实验Ⅰ组（T1～T4N1～N2M1,21例）和实验Ⅱ组（T1-T4N0M1,9例）。并选取与实验I组匹配的T4-T4N1-N2M0患者（21例）和T1～T4N0M0患者（21例）以及与实验Ⅱ组匹配的T1-T4N0M0患者（9例）作为对照。应用免疫组织化学方法检测原发灶、淋巴结转移灶及其肝转移灶中HGF和c-Met的蛋白表达水平。结果实验Ⅰ组（T1～T4N1-N2M1）原发灶HGF阳性表达率[71％（15／21）]明显高于其匹配的T1～T4N1～N2M0对照组[43％（9／21）]和T1～T4N0M0对照组[19％（4／21）]（均P〈0．05）;且c—Met阳性表达率[90％（19／21）]也明显高于T1～T4N0M0对照组[43％（9／21）,P〈0．05],但与T1-T4N1-N2M0对照组[86％（18／21）]的差异则无统计学意义（P〉0．05）。实验Ⅱ组（T1～T4N0M1）与其对照组（T1～T4N0M0）原发灶HGF阳性表达率（6／9比5／9．P〉0．05）和c-Met阳性表达率（8／9比6／9,P〉0．05）的差异均无统计学意义。实验Ⅰ组患者原发灶、淋巴结转移灶及肝转移灶中HGF和c—Met表达一致率分别为81％（17／21）和76％（16／21）。结论HGF及其受体c—Met可能对存在区域淋巴结转移的结直肠癌同时性肝转移的发生具有一定作用,而对无淋巴结转移的结直肠癌发生肝转移的作用可能较小。