人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

HPV16E7基因的原核克隆及表达

目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ｃＤＮＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。结果表明，ｐ１６原核表达载体构建成功并表达出ｐ１６非融合蛋白。     

表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的：采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV-16E6基因的表达。为观察HPV-16E6基因的小干扰片段能否在CaSki细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法：根据HPV-16E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至CaSki细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率：结果：通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到CaSki细胞株中,转染效率达到50％以上：结论：siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础：     

HPV16E7基因和P16~(INK4A)蛋白在宫颈病变中的表达及其临床意义

目的:检测宫颈病变组织中HPV16E7基因和P16INK4A蛋白的表达,分析基因表达变化的临床意义。方法:入选慢性宫颈炎和CINⅠ^Ⅱ患者81例、CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌患者57例,采用PCR扩增技术检测宫颈病变组织HPV16E7基因表达,采用免疫组化方法检测宫颈病变组织P16INK4A蛋白表达,用SPSS软件行等级相关分析和χ2检验。结果:⑴HPV16E7特异性片段阳性率在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ患者81例、CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌患者57例,采用PCR扩增技术检测宫颈病变组织HPV16E7基因表达,采用免疫组化方法检测宫颈病变组织P16INK4A蛋白表达,用SPSS软件行等级相关分析和χ2检验。结果:⑴HPV16E7特异性片段阳性率在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ中分别为17.0%、26.5%,在CINⅢ及宫颈浸润性鳞癌中分别为61.5%和74.2%;HPV16E7分布在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ中分别为17.0%、26.5%,在CINⅢ及宫颈浸润性鳞癌中分别为61.5%和74.2%;HPV16E7分布在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑵P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑵P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ分别为10.6%和30.0%,在CINⅢ和宫颈浸润性鳞癌中分别为96.0%和100%;P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ分别为10.6%和30.0%,在CINⅢ和宫颈浸润性鳞癌中分别为96.0%和100%;P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑶在HPV16E7特异性片段表达阳性的宫颈病变组织中,P16INK4A蛋白的表达均是阳性。宫颈病变组织中P16INK4A蛋白与HPV16E7的表达有相关性(r=0.482,P<0.001)。结论:HPV16E7和P16INK4A蛋白与宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生具有相关性,HPV16E7和P16INK4A蛋白可能是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的早期预测指标。     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达、蛋白结构复性及纯化

目的:构建再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达载体,获得重组人Reg Ⅳ蛋白。方法:将已构建好的pEGFP-C1-Reg Ⅳ质粒进行酶切纯化获得目的基因,并构建到pET-30a原核表达载体上,经测序鉴定后将序列正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,并用凝胶层析对表达产物进行复性纯化。结果:构建了pET-30a-Reg Ⅳ原核表达重组质粒,IPTG诱导表达出约22KD的重组蛋白,表达产物经复性纯化后获得纯度较高的目的蛋白。结论:成功构建了Reg Ⅳ原核表达载体,并成功表达了重组人Reg Ⅳ蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

Construction of Human Papillomavirus Type 16 Late Gene L1 Inducible Expression System for E. coli

本研究采用亚克隆和序列修饰策略建立了编码人类乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）主要结构蛋白Ｌ１基因的大肠杆菌可诱导表达质粒ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１。通过限制性内切酶分析验证了ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１的结构。初步表达显示携带ｐＴｒｃ９９ＡｍＨＰＶ１６Ｌ１的ＪＭ１０５在ＩＰＴＧ的诱导下可合成大小约５５ｋＤ的蛋白质,与预期结果一致     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白在COS-7细胞中表达

目的研究人乳头瘤病毒16型E6蛋白在COS-7细胞中的定位及表达。方法构建pEGFP—C1介导的HPV-16E6的真核表达载体pGFP-16E6,体外转染COS-7细胞,采用荧光显微镜观察HPV-16E6蛋白在COS-7细胞中的定位及表达。结果细胞在转染pGFP-16E6质粒后,细胞核发出明亮的绿色荧光,GFP-16E6于转染后6h开始表达,至21h表达到高峰,随后表达逐渐降低。结论HPV-16E6蛋白主要表达于COS-7细胞核内,并且表达随时间成动态变化。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

Subcloning and Expression of Human Papillomavirus Type 16 E2 Gene in E.Coli

By using molccular doning technique,the E2 gene of human papillomavirus type 16 wasexpressed in E.coli.The 3.2 kb fragment containing the E2 gene was cut out from HPV16 genomeand blunted with nuelease S1.The plasmid pBD2 DNA was linearized with Hind Ⅲ and bluntedwith nuclasc S1 too.Afler ligation,thc ligsted DNA was used to transform E.coli BMH 71-18.The positive colonies were screened by in situ hybridization technique,and proceedcd to DNA analy-sis and proton analysis.The purified expressed protein was used to run immunoclctrophoreesis withantiserum against pBD2.We concktudcd that thc expressed protcin was a fusion protein ofbeta-galae-sidasc-E2 protein.     

HPV16／18 E6蛋白及P53蛋白在宫颈癌中的状态

目的：探讨HPV16／18E6蛋白和P53蛋白在宜昌地区宫颈鳞癌组织中的表达及相关关系。方法：用免疫组化SP法对36例宫颈鳞癌及28例慢性宫颈炎中的HPV16／18E6蛋白和P53蛋白进行检测。结果：宫颈鳞癌中E6和P53阳性率均明显高于慢性宫颈炎组，并且E6阳性的宫颈鳞癌与慢性宫颈炎P53阳性率明显高于E6阴性组。结论：HPV16／18感染与宜昌地区宫颈鳞癌的发生密切相关，至于HPV16／18E6蛋白与P53蛋白之间的内在联系尚有待于进一步研究。     

调控SOX2对HPV-16阳性宫颈癌细胞增殖转移的影响

目的 探讨SOX2基因对HPV-16阳性宫颈癌细胞株增殖转移的影响。方法 培养Caski-EGFP细胞后,采用空白腺病毒、SOX2基因沉默的腺病毒载体、SOX2基因过表达的腺病毒载体转染Caski-EGFP细胞并将细胞依次分为C、S、E组。Western blot法及实时荧光定量PCR （RT-PCR）检测SOX2及mRNA水平,检测细胞是否构建成功;CCK-8细胞增殖实验检测各组癌细胞的光密度值,绘制细胞活力曲线,分析SOX2基因对宫颈癌细胞株增殖活力的影响;Transwell侵袭试验分析各组癌细胞侵袭抑制率的改变,探讨SOX2基因对宫颈癌细胞株侵袭转移能力的影响。结果 RT-PCR、Western blot法检测,结果显示mRNA、SOX2蛋白表达量分别为E组 > C组 > S组,差异有统计学意义（P<0.05）,提示构建的细胞构建成功可进行下一步实验。CCK-8细胞增殖实验结果显示,不同时间下,C组、S组、E组吸光度值、细胞活力均呈上升趋势,3组都在72h达到高峰,差异有统计学意义（P<0.01）;比较各时间点下3组癌细胞的吸光度值及细胞活力差异,癌细胞培养后第0、24、48及第72h,E组相较于对照组C组而言,癌细胞的吸光度值及细胞活力均显著升高,差异有统计学意义（P<0.01,F_C-E组间=3.764,P_C-E组间=0.001）,S组相较于对照组C组而言,癌细胞的吸光度值及细胞活力均有所降低,差异有统计学意义（P<0.01）。E组相较于对照组S组而言,癌细胞的吸光度值及细胞活力均显著降低,差异有统计学意义（P<0.01,F_组间=4.286,P_组间=0.000）;不同时间点与分组之间存在交互作用（F_交互=3.784,P_交互=0.001）;Transwell小室实验结果显示,以C组实验对照组的细胞侵袭能力设定为100%,则E组的相对侵袭抑制率为146%;S组细胞的相对侵袭抑制率为75%。对比可知,E组的细胞侵袭能力高于实验对照组C组,差异有统计学意义（P<0.01）;S组低于实验对照组C组,差异有统计学意义（P<0.05）;E组细胞侵袭能力明显高于S组,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 本研究进一步探讨了SOX2基因对高危型HPV感染（HPV-16）的宫颈癌细胞株增殖能力及侵袭转移能力方面的促进作用,抑制SOX2的表达有望成为一种早期诊断治疗宫颈癌的新途径。     

HLA-DR抗原及HPV16/18E6蛋白在宫颈癌组织的表达及意义

目的:通过检测HLA-DR抗原及HPV16/18E6蛋白在宫颈癌组织中的表达情况,探讨由HLA-DR抗原介导的免疫应答在感染高危型人乳头瘤病毒(HPV)至发展为宫颈癌过程中的作用机制。方法:采用免疫组织化学SP法检测正常宫颈、宫颈上皮内瘤病变(CIN)及宫颈癌组织中HLA-DR抗原及HPV16/18E6的表达情况。结果:HLA-DR抗原的阳性表达率在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中分别为37.5%、73.3%、81.8%,而HPV16/18E6蛋白的阳性表达率则分别为37.5%、60.0%、75.8%,两者在3组的表达差异显著,P均<0.05。HLA-DR抗原及HPV16/18E6蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率随临床分期、分化程度及淋巴结是否转移而不同,但无显著性差异,P均>0.05。结论:HLA-DR抗原递呈病毒抗原给T细胞引起的免疫应答可能在宫颈癌的发生发展过程中起重要的作用。