小鼠阴道上皮细胞与猪脱细胞真皮基质-纤维蛋白凝胶构建组织工程阴道的初步研究

目的:初步探讨利用组织工程学技术构建组织工程阴道的方法及可行性。方法:将小鼠阴道上皮细胞以1×105个/ml的密度接种到纤维蛋白凝胶内并与猪脱细胞真皮基质(PADM)复合构成移植片,体外培养48小时后,将移植片埋植到小鼠脊柱两侧皮下。移植后2周、4周、8周和12周取材,对埋植后不同时间取出的移植片行HE染色和VanGieso(VG)染色,观察和评价移植片组织的生长状况;用上皮广谱角蛋白单克隆抗体AE1/AE3进行免疫组化染色,以证实移植片是否存在上皮组织。结果:光镜下观察,皮下埋植后2周,可见少量阴道上皮细胞,4周形成上皮,仅2～3层,8～12周上皮层数增加(约4～5层)。AE1/AE3免疫组化染色结果与HE染色结果一致。VG染色显示随埋植时间推移,PADM内逐渐有细胞长入,结构逐渐降解。结论:阴道上皮细胞与PADM-纤维蛋白构建的移植物体内移植后有血管长入,形成的上皮组织表型与正常阴道上皮表型相同。     

组织工程医用生物补片用于阴道重建的动物实验研究

目的 观察应用组织工程医用生物补片(一种脱细胞真皮基质材料)在实验动物体内进行阴道重建的效果.方法 对12只中国小型实验猪行阴道全切除术,应用组织工程医用生物补片行阴道重建术,分别于术后1、2、4、6、8、12周每次选择2只实验猪切除全层阴道,并以其中2只实验猪阴道切除术中切除的正常阴道组织为对照.对阴道重建术后不同时间切除的阴道组织行HE染色和Van Gieson(VG)染色,以观察和评价阴道各层组织的生长状态;采用上皮广谱角蛋白单克隆抗体AE1/AE3、平滑肌α肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体进行免疫组化染色,以证实重建阴道是否存在上皮组织和平滑肌组织;于重建术后1、12周行透射电镜检查,观察阴道组织超微结构的变化;于重建术后12周应用组织浴槽对离体阴道组织进行药物和电刺激,以评价阴道平滑肌的收缩功能.结果 (1)阴道重建术后1周,可见阴道黏膜覆盖近2/3,光镜下观察,阴道上皮层数少,仅1～2层;电镜下观察,上皮细胞排列疏松,不规则.阴道重建术后4～6周,可见黏膜上皮层数增多,达4～5层.重建术后12周,大体上很难与正常阴道区分,上皮广谱角蛋白单克隆抗体AE1/AE3免疫组化染色结果与HE染色结果一致;电镜下观察,阴道上皮细胞分层分化良好,排列有序,细胞的相邻面有桥粒连接.(2)VG染色、免疫组化染色显示,阴道重建术后4周,开始出现散在的平滑肌细胞,此后逐渐形成排列均匀的肌束.(3)阴道重建术后12周,重建的阴道与正常阴道组织对KCl刺激均能产生收缩波,收缩反应强度变化相似,分别为(2.96±0.29)和(3.14±0.30)g;对于不同电压、不同频率的电刺激,当电压固定、频率逐渐升高时,两者收缩反应强度变化分别为(3.43±0.34)和(4.65±0.73)g;当频率固定、电压逐渐升高时,两者收缩反应强度变化则分别为(4.92±0.38)和(4.89±0.44)g.结论 组织工程医用生物补片是在实验动物体内进行阴道重建较理想的材料,重建术后3个月基本可以完成组织重建.     

阴道上皮细胞的抗念珠菌作用及雌激素对此的影响

目的 :研究阴道上皮细胞对白色念珠菌生长的抑制作用及雌激素对此作用的影响。方法 :用酶消化法分别分离雌激素处理组、动情间期组和去势组小鼠阴道上皮细胞作为效应细胞 ,白色念珠菌芽生孢子作为靶细胞 ,将效靶细胞共同孵育 9h ,测定白色念珠菌生长抑制率 ,观察其生长密度及透射电镜下超微结构的改变。结果 :白色念珠菌与阴道上皮细胞共同孵育后 ,生长受到抑制 ,生长密度降低 ,超微结构表现为与阴道上皮细胞靠近的念珠菌细胞壁崩解 ,细胞膜连续性破坏 ,甚至细胞器肿胀溶解。雌激素处理组与去势组和动情间期组比较 ,阴道上皮细胞对念珠菌的生长抑制率降低 (P <0 .0 5 )。结论 :小鼠阴道上皮细胞具有天然的抗白色念珠菌作用 ,雌激素能降低此抑制作用。     

乙状结肠代阴道成形术后阴道黏膜细胞形态及闭锁蛋白、带状闭合蛋白1表达的变化

/15)],差异也有统计学意义(P<0.05);而与其上段黏膜细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05).在成形术后阴道下段鳞状上皮化生的黏膜细胞中,两种蛋白的阳性表达率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 乙状结肠代阴道成形术后,部分阴道下段黏膜发生了鳞状上皮化生;成形术后阴道上段及下段未发生鳞状上皮化生的黏膜细胞中,闭锁蛋白及ZO-1阳性表达率下降;化生的鳞状上皮细胞中,两种蛋白的表达与原位的乙状结肠黏膜相似,可能对加强人工阴道的防御功能起到了一定作用.     

乙状结肠代阴道成形术后阴道黏膜细胞形态及闭锁蛋白、带状闭合蛋白1表达的变化

/15)],差异也有统计学意义(P<0.05);而与其上段黏膜细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05).在成形术后阴道下段鳞状上皮化生的黏膜细胞中,两种蛋白的阳性表达率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 乙状结肠代阴道成形术后,部分阴道下段黏膜发生了鳞状上皮化生;成形术后阴道上段及下段未发生鳞状上皮化生的黏膜细胞中,闭锁蛋白及ZO-1阳性表达率下降;化生的鳞状上皮细胞中,两种蛋白的表达与原位的乙状结肠黏膜相似,可能对加强人工阴道的防御功能起到了一定作用.     

人阴道黏膜干细胞的筛选与培养

目的:探讨人阴道黏膜干细胞(vaginal mucosa stem cells,VMSCs)的分离、筛选与适合的体外培养方法。方法:用胰酶、胶原酶混合消化法获得阴道黏膜细胞。以丝裂酶素C处理的小鼠成纤维细胞作滋养层细胞。将20min内黏附于Ⅳ型胶原的阴道黏膜细胞定为VMSCs。对筛选的VMSCs与原代人阴道黏膜细胞分别用碘化丙啶(PI)一步荧光染色法,用流式细胞仪检测其细胞周期。分为4组体外培养原代VMSCs,第1组用滋养层细胞+上皮细胞完全培养液;第2组滋养层细胞+DMEM/F12(3:1);第3组无滋养层细胞+上皮细胞完全培养液;第4组无滋养层细胞+DMEM/F12(3:1)。培养至12天,比较各组的CK19、CK10阳性细胞的比例、克隆形成率(clony forming efficiency,CFE)与凋亡前传代的次数。结果:筛选的VMSCs与原代人阴道黏膜细胞的G_0/G_1细胞比例、CK19、CK10细胞阳性比例均有统计学差异(P＜0．05)。用滋养层细胞+上皮细胞完全培养液培养VMSCs12天的CFE与CK19阳性细胞比例最高,CK10阳性细胞比例最低,体外培养VMSCs能稳定传代15代以上。结论:Ⅳ型胶原快速黏附法可有效地筛选VMSCs。滋养层细胞+上皮细胞完全培养液为体外培养原代VMSCs的较佳方法。     

大鼠子宫全层损伤修复模型的建立

目的:建立SD大鼠子宫全层损伤后修复模型,并探索子宫损伤后形态及功能重建的规律。方法:SD大鼠子宫全层损伤,根据损伤范围不同分为A组(0.5cm×0.5cm)、B组(1.0cm×0.5cm)、C组(1.5cm×0.5cm)、D组(假手术)四组。术后1周、2周、4周、8周、12周,对子宫创面的愈合情况行大体观察及组织学分析。术后12周行妊娠试验。结果:大体观察显示,A、B、C组的子宫术后宫腔通畅率分别为96%、84%和56%。术后1周,3组手术区即可见上皮再生。术后2~4周,Masson染色及免疫组化染色可见平滑肌修复,同一时间点A、B、C 3组手术区平滑肌细胞含量(α-SMA)比较,差异有统计学意义。术后12周,4组的妊娠率比较差异有统计学意义(P=0.006),A组手术区可见正常发育至晚孕期的胚胎,B组、C组手术区胚胎少见或未见。结论:全层机械损伤大鼠子宫模型是理想的子宫损伤修复动物模型。子宫损伤后形态学、功能学的自然修复与损伤程度有关,损伤范围增大,子宫自然修复不能实现完全重建,有待进一步干预。     

猪小肠黏膜下层补片植入兔膀胱阴道间隙的转归研究

目的观察猪小肠黏膜下层(SIS)补片植入兔膀胱阴道间隙的转归,探讨SIS补片在妇科盆底手术中的应用价值。方法以家兔作为动物模型,16只雌性家兔随机(抽签法)分为4组,即7 d组、30 d组、90 d组和180 d组,每组4只家兔。4组家兔均通过手术方式于膀胱阴道间隙内植入SIS补片,分别于术后7、30、90、180 d处死各组家兔,并同时整块取出补片及其周围的膀胱阴道组织。标本均制成蜡块后切片,采用HE染色观察补片内部及周围组织产生的形态学变化,采用Masson染色观察补片组织内胶原形态和数量的变化。结果(1)HE染色后光镜下观察,7 d组SIS补片周围可见大量以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,并可见新生血管形成;30 d组炎性细胞浸润区域进一步增大;90 d组炎性细胞浸润区域明显缩小;180天组炎性反应基本消退。(2)Masson染色后光镜下观察,7 d组4只家兔SIS补片胶原结构清晰,保留完整;30 d组4只家兔SIS补片已有部分降解,但仍可见SIS胶原结构;90 d组有2只家兔尚可见少量残留SIS碎片结构,另2只家兔的SIS补片已被完全降解;180 d组4只家兔的SIS补片均被完全降解,其中1只家兔似可见部分有排序的胶原结构。结论SIS补片植入兔膀胱阴道间隙后可导致一过性的非感染性炎症反应,植入180 d后可被完全降解并有少量新生胶原结构产生。SIS补片用于盆底重建手术需谨慎。     

复方沙棘籽油栓对体外白假丝酵母菌感染受损阴道上皮细胞保护作用的研究

目的探讨中成药复方沙棘籽油栓对体外受损阴道上皮黏膜的修复作用。方法于2015年9月至2016年9月在北京大学第一医院妇产科微生态实验室进行相关实验技术操作。白假丝酵母菌预处理阴道上皮细胞系(ATCC-CRL2616)12 h,造成阴道上皮细胞形态结构以及功能改变后,将受损的阴道上皮细胞在复方沙棘籽油栓的干预下培养24 h后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)以及扫描电镜观察细胞形态和功能的修复情况。结果白假丝酵母菌预处理阴道上皮细胞12 h后,Ig G的分泌量明显减少(0.24±0.02)mg/L,扫描电镜下可见细胞膜破裂,细胞形态不完整;复方沙棘籽油栓干预受损阴道上皮细胞24 h后,Ig G的分泌量明显增加(0.42±0.10)mg/L,扫描电镜下可见阴道上皮细胞形态、活力较好,足突黏附性强,上皮细胞胞膜相对完整,细胞表面光滑,表面布满微绒毛及微绒毛嵴。结论复方沙棘籽油栓可以调节阴道黏膜上皮的局部免疫功能,修复受损上皮。     

中性蛋白酶和胰酶分离阴道黏膜上皮细胞的对比研究

目的:建立新的阴道黏膜上皮细胞分离方法,体外培养阴道黏膜细胞供进一步研究.方法:利用中性蛋白酶(dispase)和胰酶分离人阴道黏膜上皮细胞,并通过形态学、角蛋白13(CK13)染色、细胞产量和克隆形成率等比较分离效果.结果:dispase组的细胞产量及克隆形成率更高.形态学和CK13染色均可见胰酶的分离作用并不完整,细胞大部分仍附于固有层.而dispase组基底细胞则完整地分离开.结论:酶消化法能成功分离阴道黏膜细胞,在体外生长良好,而dispase分离效果更好.