人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体并分离纯化获得重组GDF-9蛋白。方法:以cDNA克隆为模板,PCR法扩增出人GDF-9基因,将目的基因连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/GDF-9,脂质体法将重组质粒转染到HEK293T细胞,通过Western blotting检测GDF-9蛋白表达。结果:以双酶切及基因测序鉴定构建的重组真核质粒,Western blotting方法证实人GDF-9基因正确表达。结论:成功构建人GDF-9基因pcDNA3.1(+)/GDF-9重组质粒,并在真核细胞系表达,获得重组GDF-9蛋白,为进一步研究GDF-9基因提供便利工具。     

溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响

目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响。方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增UreG全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中。在E.coliBL21中,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达His融合蛋白。用亲和层析纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取多克隆抗体。观察该抗体对小鼠体外受精的影响。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA检测证实,免疫小鼠产生了高效价的抗体。该抗体能够抑制小鼠精卵的融合。结论:与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体,可导致小鼠精卵结合率降低。     

37LRP基因表达载体构建及蛋白表达的研究

目的 研究克隆宫颈癌HeLa细胞层粘连蛋白受体前体(37-kDa laminin receptor precursor, 37LRP)并构建表达载体及成功表达该受体蛋白。 方法 采用RT-PCR从宫颈癌HeLa细胞总RNA中扩增人37LRP受体的cDNA序列,克隆到pGEM-T Easy载体上。经过序列测定后插入到表达载体pET22b(+),在大肠杆菌BL21(DE₃)中诱导表达。 结果 构建的表达载体经限制性内切酶分析和DNA测序并与GenBank比对,证明所构建的重组质粒含有37 LRP插入片段,经诱导后表达37 LRP蛋白。 结论 成功构建了重组人37 LRP表达载体,并获取重组人37 LRP蛋白,为临床肿瘤的研究奠定了基础。     

肿瘤抑制基因Nm23-M1原核表达载体的构建和表达

目的:构建鼠Nm23-M1基因的原核表达载体并进行表达。方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术扩增Nm23-M1基因,将其克隆于pQE30质粒中,测序正确后,构建重组体pQE30-Nm23-M1,在大肠杆菌中诱导NM23-M1蛋白表达。结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示,在分子量大约17.5kD处有一诱导表达蛋白带,表达蛋白量占菌体蛋白量的15%,通过Westernblot证实,表达产物与抗人Nm23-H1单克隆抗体有特异性免疫反应。经Ni-NTA柱纯化,获得电泳均一性为92%的重组蛋白。结论:成功构建Nm23-M1表达载体,并获得了重组NM23-M1蛋白。     

Expression, Purification and Identification of Recombinant Early Pregnancy Factor(EPF)

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白.方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF).再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白.用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性.结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA.EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白.Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性.结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础.     

重组早孕因子(EPF)的表达、纯化及鉴定

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF)。再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性。结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA。EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白。Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性。结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础。     

hCGβ-(CTP)_4和hCGβ-(CTP)_4-(C3d-P28)_4在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中表达hCGβ-(CTP)_4、hCGβ-(CTP)_4-(C3d-P28)_4融合蛋白,并对蛋白进行分离纯化。方法:将pBSMR-(CTP)_4中的(CTP)_4基因片断克隆入表达载体pET-28a(+),得到表达质粒pET-28a(+)-(CTP)_4。将PCR获得的补体C3d-P28 DNA序列以头尾串连的方式构建四聚体。将(C3d-P28)_4基因片断克隆入pBSMR-(CTP)_4,得到pBSMR-(CTP)_4-(C3d-P28)_4,进一步得到表达质粒pET-28a(+)*(CTP)_4-(C3d-P28)_4。将表达质粒pET-28a(+)-(CTP)_4和pET-28a(+)-(CTP)_4- (C3d-P28)_4分别转化入大肠杆菌BL21(DE3),表达融合蛋白hCGβ-(CTP)_4和hCGβ-(CTP)_4-(C3d-P28)_4。采用Ni-NTA-resin和凝胶过滤方法纯化蛋白。结果:菌株经IPTG诱导后检测到目的基因的表达产物, SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白的分子量分别为27kD和40kD左右。结论:在BL21 (DE3)中成功表达了hCGβ-(CTP)_4和hCGβ-(CTP)_4-(C3d-P28)_4融合蛋白,并确立了纯化方法,为进一步研究其免疫原性和应用于抗肿瘤疫苗奠定了基础。     

LV-EGFP-inhba过表达慢病毒载体转染大鼠卵巢颗粒细胞的实验研究

目的:构建inhba基因过表达的慢病毒载体(lenti-EGFP-inhba),观察体外转染大鼠卵巢颗粒细胞的有效性。方法:p LVX-EGFP-3FLAG质粒系统经EcoRI酶切使之线性化。inhba基因(NM_008380)PCR扩增后同源重组入线性化的表达质粒系统。Western blot法检测表达质粒目的基因表达。将构建成功的慢病毒载体(lenti-EGFP-inhba)转染大鼠卵巢颗粒细胞(MOI=20),检测目的基因表达。结果:PCR扩增产物与目的基因大小吻合,重组质粒系统经转化后获得阳性克隆,转染293T细胞可见EGFP-inhba融合蛋白表达。Western blot获得76k Da分子量大小阳性条带,与融合蛋白分子量大小一致。lentiEGFP-inhba体外转染大鼠卵巢颗粒细胞,倒置荧光显微镜下可见EGFP表达。结论:lenti-EGFP-inhba表达载体成功构建,并可在体外有效转染大鼠卵巢颗粒细胞。     

沙眼衣原体热休克蛋白10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:从临床标本中获得构建真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染Hela细胞获得cHSP10。方法:用PCR法从金标法检测为阳性的临床标本中扩增cHSP10基因片断,重组λpMD18-T克隆载体。将pMD18-T/cHSP10中的外源基因片断经酶切鉴定后,克隆入λpcDNA3.1(+)中,经序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将该重组体转染Hela细胞,间接免疫荧光法观察目的基因的表达。结果:PCR扩增得到的306bpcHSP基因全长,序列测定与GenBank(M58027)发布序列一致;构建得到cHSP10基因真核表达载体;该真核表达载体在Hela细胞表达cHSP10。结论:成功构建了cHSP10基因真核表达载体,该重组质粒能在Hela细胞中表达cHSP10。