武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析

目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况。方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A~H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rt L80、rt L169、rt V173、rt L180、rt A181、rt T184、rt A194、rt S202、rt M204、rt N236和rt M250,判断对HBV耐药的核苷类似物。结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61%,C型占26.75%,D型占0.64%。共有68例(43.31%)耐药,其中B型70.59%,C型29.41%,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(χ2=0.379,P0.05)。对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29%,其中B型占73.17%,C型占26.83%;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+204V位点耐药12例,180M+204V/I位点耐药6例。对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41%,基因B型占75.0%,基因C型占25.0%,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例。对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35%,基因B型3例,基因C型2例。拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94%,均为基因C型。替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06%,基因B型75.0%,基因C型25.0%。结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药。临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案。     

耐核苷(酸)类药物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P区耐药突变位点分析

目的了解慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布和P区耐药突变位点的变异模式。方法选择39例经核苷(酸)类似物(NAs)治疗后存在耐药或疑似耐药的慢性乙型肝炎和肝硬化患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR法测定血清HBV DNA,将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,鉴定和回收纯化后,交由上海生工生物工程(北京)有限公司进行测序,与HBVseq数据库比对,观察HBV基因型分布和耐药位点变化情况。结果 34例(87.2%)患者能检出HBV基因型,其中C基因型有32例(82.1%),B基因型有2例(5.1%);27例(69.2%)患者存在RT区序列突变,其中点变异12例(30.8%),rt M204I/V/S、rt A181V/T、rt I169T突变分别占15.4%、5.1%、10.3%,组合变异15例(38.4%);23例患者存在对NAs耐药,其中8例患者对阿德福韦酯耐药(1例为B基因型,7例为C基因型),耐药位点为rt A181V/T/S、rt V214A/E和rt N236T;11例患者对拉米夫定和替比夫定同时耐药,均为C基因型,其共同耐药位点为rt M204I/V/S和rt L180M;3例患者存在对LAM、LDT和恩替卡韦同时耐药,均为C基因型;1例C基因型患者对LAM、LDT和ADV同时耐药,其变异模式为rt M204I/V/S+rt A181V/T/S+rt L180M。结论多数对NAs耐药患者可在HBV P区检出基因突变,且突变形式多样,其中以rt M204I/V/S突变为主,不同核苷(酸)类似物中存在共同耐药位点。     

740例 HBV 感染者血清 HBV 逆转录酶区耐药位点分析

目的：了解乙型肝炎病毒（HBV）感染者 HBV 基因型的构成状况及 HBV P 区基因变异的特点。方法对2010年8月～2011年10月送检的740份 HBV 感染者血清,采用 ABI 基因测序仪检测 HBV 耐药位点和基因型,应用 SPSS15.0软件进行统计分析。结果在740例 HBV 感染者中,检出 HBV B 基因型40例（5.41%）,C 基因型695例（93.92%）,D 基因型5例（0.68%）;与拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦耐药明确相关的位点突变377例（50.95%）,其中195例（51.72%）患者既往有明确的应用核苷（酸）类似物（NA）史,在这195例发生耐药的患者中,B基因型12例,C 基因型183例,两基因型间耐药发生率无明显差异,他们中包括 CHB 患者118例,肝硬化患者77例,主要耐药变异模式为 M204V＋L180M、M204I、M204I＋L180M 和 A181V,两组间 ALT、HBV DNA 载量和主要耐药变异模式检出率均无统计学差异;HBV DNA 载量是影响 NA 耐药的相关因素（x2=0.496,P〈0.001）,但耐药与年龄、性别、疾病严重程度（CHB 或肝硬化）和 ALT 水平无显著性相关;此外,本文还检出多处未知变异位点,如 rt64、rt126、rt178和 rt129等。结论核苷（酸）类似物的使用将伴随病毒变异的发生,其耐药基因变异位点具有一定的特点及规律性,动态监测 HBV DNA 载量对早期发现耐药有一定的价值。     

慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其耐药基因突变分析

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV基因型及其耐药突变发生情况。方法纳入240例接受核苷(酸)类似物单药或联合或序贯治疗的CHB患者,采用PCR扩增HBV逆转录(RT)区和序列测定鉴定耐药基因突变,采用HBV S基因测序法鉴定基因型。结果在35例单用拉米夫定治疗的CHB患者中,发生耐药突变14例(40.0%),突变位点为rt L80I/V、rt Vl73L、rt Ll80M、rt M204V/I和rt V207I,23例单用阿德福韦治疗者发生耐药突变11例(47.8%),突变位点为rt Al81T/V、rt S213T/N、rt V214A、rt Q215S/H/P、rtl233V、rt N236T、rt P237H和rt N/H238A/K/D/S,70例单用恩替卡韦治疗者发生耐药突变10例(14.3%),突变位点为rt M204I,12例单用替比夫定治疗者发生耐药突变5例(41.7%),突变位点为rt I169T、rt L180M、rt T184G/S/A/I/L/F、rt S202I/G、rt M204V和rt M250V/I/L,100例接受联合或序贯治疗者发生耐药突变51例(51.0%),突变位点为rt A194T,恩替卡韦治疗患者耐药突变发生率最低(P0.05);240例CHB患者中,HBV基因B型21例(8.8%)、C型216例(90.0)和D型3例(1.2%);在发生耐药突变的91例患者中,B型6例(6.6%)、C型83例(91.2%)和D型2例(2.2%,x2=1.22,P0.05);在发生耐药突变的6例B型感染者中有2例(33.3%)和83例C型感染者中有15例(18.1%)发生了多重耐药突变。结论检测CHB患者感染HBV基因型并及时获得耐药突变基因分布,将有助于指导临床治疗。     

乙型肝炎病毒RT区原发性耐药变异的研究

目的探讨核苷(酸)类似物(NA)治疗前乙型肝炎病毒(HBV)RT区原发性耐药变异的发生情况。方法采用PCR产物直接测序技术对61例未接受NA治疗的慢性HBV感染者进行HBV RT区序列测定,分析NA治疗前HBV RT区原发性耐药变异的发生率。结果通过HBV基因扩增、PCR产物直接测序后,共获得61个HBV RT区基因序列,采用HBV RT区基因进化树基因分型共分出B型42例(42/61,68.85%),C型19例(19/61,31.15%),未检出其他基因型。通过核苷酸序列及氨基酸序列分析,对NA常见的10个耐药变异位点(rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G/S/A/I、rtA194T、rtS202I/G、rtM204I/V、rtN236T、rtM250V)进行比对后,61例患者中共检出HBV RT区变异3例(rtM204I 2例,rtM204I+L180M 1例),自然耐药变异的检出率为4.92%。结论慢性HBV感染者存在少量RT区原发性耐药变异位点,与原发性无应答有关。     

慢性HBV相关肝病患者HBV基因型和耐药突变位点与疾病进展的关系

目的 探讨慢性HBV相关肝病患者HBV基因型和耐药突变位点检测与疾病进展的关系.方法 选取230例经核苷(酸)类似物(NAs)治疗的慢性HBV相关肝病患者作为研究对象,检测其外周血HBV基因型和RT区氨基酸序列耐药突变情况.结果 230例慢性HBV相关肝病患者中100例(43.47％)检出NAs耐药突变,以LAM/Ld...     

658例乙型肝炎患者HBV多位点耐药基因检测结果分析

目的分析乙型肝炎患者HBV核苷(酸)类似物耐药相关的10个位点的突变情况及其临床意义。方法采用焦磷酸测序法对658例各型乙型肝炎患者行核苷类似物抗乙肝病毒多位点耐药基因检测并分析不同核苷(酸)类似物耐药的突变形式,对常见突变模式者ALT和HBV-DNA水平进行比较。结果 300例发生不同位点变异,变异率为45.59%,其中有明确用药史者202例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见,前者通常伴随L180M突变,后者常单独出现;阿德福韦酯耐药中以N236T和A181位碱基替换为主;恩替卡韦耐药均伴随拉米夫定和阿德福韦酯耐药变异,以T184位点的碱基替换最为常见;主要变异模式间ALT及HBV-DNA水平均无明显差异。90例未接受过核苷(酸)类似物治疗者亦检出耐药相关突变。结论检测HBV多位点耐药基因相关突变有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者HBV耐药并指导抗病毒治疗。     

核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎患者HBV基因耐药变异影响因素分析

目的研究核苷(酸)类似物抗HBV治疗中病毒聚合酶基因区耐药突变的相关因素。方法从我院行HBV聚合酶基因区序列测定的患者中,选择持续单一或联合应用核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎(乙肝)和乙肝肝硬化患者,分析其宿主、病毒和药物等对HBV基因耐药变异的影响,包括性别、年龄、诊断、HBV基因型、HBeAg、HBVDNA水平、ALT、AST、TBIL及药物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、拉米夫定┼阿德福韦酯联合治疗)。结果分析结果显示,年龄、血清HBVDNA水平、HBeAg(-)和核苷(酸)类似物种类是影响病毒聚合酶基因区突变的相关因素。结论年龄>40岁且HBeAg(-)的血清高病毒载量的慢性乙肝患者,在临床上病毒耐药发生率较高。对于核苷(酸)初治的慢性乙肝患者,恩替卡韦单药治疗与拉米夫定┼阿德福韦酯联合治疗耐药发生率相似,显著低于拉米夫定单药和阿德福韦酯单药治疗。     

拉米夫定、阿德福韦酯治疗一例患者后乙型肝炎病毒P基因序列的演变与分析

目的 了解对拉米夫定(LAM)和阿德福韦酯(ADV)临床耐药慢性乙型肝炎患者治疗前后HBV P基因序列变化.方法 选择患者治疗前、LAM治疗后1年、更换ADV治疗后1年3个时间点标本,采用一步法扩增HBV株P基因,随机挑选5个克隆进行测序,分析核苷酸和氨基酸的变化.结果 治疗前和ADV治疗1年后血清所有克隆的HBV均为B基因型,LAM治疗1年后血清所有克隆的HBV均为C基因型.LAM治疗后1年,5个克隆中有4个发生rtM204I变异,并伴随rtI91L(A区)、rtS256C(E区)双突变,还有10个氨基酸发生变异.ADV治疗1年后,所有克隆的HBV均转为无YMDD突变的病毒株,spacer domain区发生27～183个碱基缺失,同时有21个氨基酸发生变异,未见rtN236T和rtA181V/T相关变异.与治疗前序列对比,有15个氨基酸发生替代.结论 核甘(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎过程中,HBV是否发生基因型转换有待证实,spacer domain区大片段碱基缺失可能与HBV对ADV耐药相关.     

拉米夫定耐药HBV毒株的RT区序列分析

目的分析拉米夫定耐药HBV毒株部分RT区序列，以了解RT区YMDD基序之外HBV的变异情况。方法采用PCR方法对拉米夫定临床耐药患者治疗前及耐药后血清HBV部分RT区序列进行扩增，扩增的核苷酸片段覆盖HBV RT的B区～E区及S基因“a”决定簇，对PCR产物进行直接测序，将HBV RT区核苷酸和推导的氨基酸序列-与治疗前50株HBV野毒株序列和Genebank中77株不同基因型野毒株序列进行比较，同时对HBV进行血清分型。结果60例患者有YMDD变异，其中26例为adw亚型，占43．33％；34例为adr亚型，占56．67％。另外12例患者(16．67％)未发现YMDD变异。16例患者出现11个RT保守区氨基酸变异(不包括550和526位氨基酸变异)；25例患者出现19个HBVRT非保守区氨基酸变异。结论拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于RT B区的526和C区550两个位点，B、C区的其他位点、保守区以及RT非保守区也可发生多个变异。     

拉米夫定耐药株感染者HBV基因型和逆转录酶区变异分析

目的了解拉米夫定耐药株感染者HBV基因型特征并分析耐药株HBV逆转录酶（RT）区变异位点和变异类型。方法应用PCR扩增和直接测序HBV逆转录酶区并与Genebank中90株不同基因型野毒株序列进行比较,确定54例耐药株感染者HBV基因型和HBVRT核苷酸的变异特点。结果在54例拉米夫定耐药株感染者中,HBVB基因型占27．78％,C型占70．37％,B／C混合型占1．85％;51例患者出现RT保守区氨基酸变异（包括550和526位氨基酸变异）;18例患者出现除主型区外HBVRT非主型区伴随变异;3例患者未检测到与拉米夫定相关性变异。结论拉米夫定耐药株感染者HBV基因型主要为B型和C型;拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于RT区的526和550两个位点,其他位点以及RT非保守区也可发生变异。     

逆转录酶区A181T/V和A181T/V＋N236T变异的乙型肝炎病毒感染者临床特征分析

目的：比较逆转录酶区A181T/V变异与A181T/V＋N236T变异的乙型肝炎病毒感染者临床特征的异同。方法对55例发生rtA181T/V单独变异和34例发生rtA181T/V＋rtN236T联合变异的乙型肝炎病毒感染者既往核苷（酸）类似物治疗情况进行回顾,对耐药时谷丙转氨酶、谷草转氨酶、HBV M、HBV DNA等指标进行检测,并根据耐药测序结果确定病毒的基因型。结果阿德福韦单药治疗患者发生A181T/V＋N236T变异较A181T/V变异的比例高（57.6%对42.4%,P〈0.05）,而拉米夫定换用（或加用）阿德福韦治疗患者发生 A181T/V 变异较A181T/V＋N236T变异的比例高（75.5%对24.5%,P〈0.05）;在89例患者中B基因型和C基因型分别是14例和75例,不同变异在B或C基因型中的分布无统计学差异;A181T/V变异与A181T/V＋N236T变异相比,两组患者的年龄、性别构成、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、HBV DNA、HBsAg定量、HBeAg状态等指标均无统计学差异。结论不同的核苷（酸）类似物治疗可导致A181T/V变异和A181T/V＋N236T变异模式的差异,但这两种变异感染者临床指标无明显差异。     

反向杂交法检测乙型肝炎病毒3种核苷(酸)类似物耐药突变

目的 建立一种同时检测HBV 3种核苷(酸)类似物耐药突变的方法.方法 以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计26条特异性寡核苷酸探针,包括I169T,V173L/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G,M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L,并固定于带正电荷的尼龙膜上.利用地高辛标记的靶DNA扩增产物与固定于膜上的特异性探针的反向杂交,检测HBV 3种核苷(酸)类似物的耐药突变.应用反向杂交法分别检测HBV野生和耐药标准株,以及40例患者血清标本,观察其检测特异性和准确性.结果 反向杂交法检测HBV野生和耐药标准株,有效地区分了1169T,V173L,L180M,A1811T,T184G,S202I,M204V,Q215S,N236T,M250V 10个耐药位点上的特异性探针.40例患者血清标本中,37例临床病例的耐药检测结果 与直接测序法一致.结论 反向杂交法可以快速,准确的检测出HBV3种核苷类似物耐药突变,有助于这3种药物耐药的诊断和个体化治疗.     

反向杂交法检测乙型肝炎病毒3种核苷(酸)类似物耐药突变

目的 建立一种同时检测HBV 3种核苷(酸)类似物耐药突变的方法.方法 以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计26条特异性寡核苷酸探针,包括I169T,V173L/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G,M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L,并固定于带正电荷的尼龙膜上.利用地高辛标记的靶DNA扩增产物与固定于膜上的特异性探针的反向杂交,检测HBV 3种核苷(酸)类似物的耐药突变.应用反向杂交法分别检测HBV野生和耐药标准株,以及40例患者血清标本,观察其检测特异性和准确性.结果 反向杂交法检测HBV野生和耐药标准株,有效地区分了1169T,V173L,L180M,A1811T,T184G,S202I,M204V,Q215S,N236T,M250V 10个耐药位点上的特异性探针.40例患者血清标本中,37例临床病例的耐药检测结果 与直接测序法一致.结论 反向杂交法可以快速,准确的检测出HBV3种核苷类似物耐药突变,有助于这3种药物耐药的诊断和个体化治疗.     

反向杂交法检测乙型肝炎病毒3种核苷(酸)类似物耐药突变

目的 建立一种同时检测HBV 3种核苷(酸)类似物耐药突变的方法.方法 以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,设计2对地高辛标记的通用引物,扩增HBV聚合酶的逆转录区.针对拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦10个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计26条特异性寡核苷酸探针,包括I169T,V173L/G,L180M,A181T/V,T184G,S202I/G,M204V/I,Q215S,N236T,M250V/I/L,并固定于带正电荷的尼龙膜上.利用地高辛标记的靶DNA扩增产物与固定于膜上的特异性探针的反向杂交,检测HBV 3种核苷(酸)类似物的耐药突变.应用反向杂交法分别检测HBV野生和耐药标准株,以及40例患者血清标本,观察其检测特异性和准确性.结果 反向杂交法检测HBV野生和耐药标准株,有效地区分了1169T,V173L,L180M,A1811T,T184G,S202I,M204V,Q215S,N236T,M250V 10个耐药位点上的特异性探针.40例患者血清标本中,37例临床病例的耐药检测结果 与直接测序法一致.结论 反向杂交法可以快速,准确的检测出HBV3种核苷类似物耐药突变,有助于这3种药物耐药的诊断和个体化治疗.