葡萄球菌核酸酶去C-末端的肽段52和79的分离纯化

①目的建立金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）去Ｃ－末端的肽段５２（ＳＮ５２）和７９（ＳＮ７９）的提纯方法，并鉴定其纯度。②方法应用低温乙醇沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００柱层析分离纯化；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和高效液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度。③结果纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定均为单一区带；ＨＰＬＣ鉴定均为一个峰。④结论纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９已达电泳纯和层析纯，可用于其构象的比较研究。     

人血清淀粉样蛋白P的分离,纯化及抗血清的制备

目的分离、纯化人血清淀粉样蛋白Ｐ（ＳｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＰ，ＳＡＰ）；利用新西兰大白兔制备抗血清。方法新鲜人血清２００ｍｌ与等体积４％琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ）混合，在钙离子存在条件下分离ＳＡＰ，然后用二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶ＣＬ—６Ｂ（ＤＥＡＥ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ）离子交换层析技术进一步纯化ＳＡＰ，用火箭电泳检测ＳＡＰ组分，用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）检测其纯度，经Ａ２８０（１％）＝１８２测定其含量。用纯化的ＳＡＰ与完全佐氏试剂混合注射于新西兰大白兔背部皮内，每次１００μｇ，间隔１０天，连续３次，第四次２００μｇ，ＳＡＰ总用量为５００μｇ，１０天后取血制备抗血清。结果从２００ｍｌ人血清中提取纯品２４ｍｇ，产率约４０％。抗血清经双向扩散法测定效价为１：１６。结论该改良法，操作简便，节省时间，但ＳＡＰ产率并不低。     

两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白

本法先使血浆中的脂蛋白快速富集浓缩，再将脂蛋白各组份分离纯化。即具备序列漂浮法分离样品量大的长处，又具有密度梯度法离心时间短的优点。使用ＢＥＣＫＭＡＮＬ８－８０Ｍ型超速离心机，Ｔｙｐｅ７０Ｔｉ转头，分离２８０ｍｌ血浆只需超速离心５ｈ。所得极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）及低密度脂蛋白（ＬＤＬ）经琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳（ＰＡＧＥ）及载脂蛋白ＳＤＳ－聚丙烯酰胺电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）鉴定纯度良好。本文为超速离心分离制备大量血浆ＶＬＤＬ、ＬＤＬ提供了一种快速、经济的新方法。     

人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化

①目的分离纯化人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）。②方法应用正丁醇抽提、丙酮沉淀、热处理、ＤＥＡＥ－纤维素和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析，从人类胎盘中提纯ＰＬＡＰ；聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）和高压液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳测其亚基分子量。③结果ＰＬＡＰ的纯化倍数为１６１倍，比活力为１３８ｍｍｏｌ·ｓ－１／ｇ；纯化的ＰＬＡＰ经ＰＡＧＥ鉴定为单一区带，ＨＰＬＣ分析为单一对称峰；测得酶的亚基分子量为６４．６９ｋｕ．④结论纯化的ＰＬＡＰ已达电泳纯和层析纯，可用于其结构与功能的研究     

葡萄球菌核酸酶去C—末端的肽段52—79的分离纯化

目的 建立金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）去Ｃ－末端的５２（ＳＮ５２）和７９（ＳＮ７９）的提纯方法，并鉴定其纯度。方法 应用低温乙醇沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００柱层析分离纯化；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和高效液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度。结果 化的ＳＮ５２和ＳＡＮ７９级ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为单一区带；ＨＰＬＣ鉴定均为一个峰。结论 纯     

抗hTSH抗独特型抗体的制备：——免疫原的分离纯化及鉴定

本文根据独特型－抗独特型理论探讨Ｇｒａｖｅｓ′病的发病机理，报道了对兔抗ｈＴＳＨＩｇＧ免疫原的分离，纯化及鉴定。首先用饱和硫酸铵粗提兔抗ｈＴＳＨ血清γ－球蛋白，继以葡萄球菌Ａ蛋白琼脂糖凝胶亲和层析柱（ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ）纯化ＩｇＧ，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯凝胶电泳（ＳＰＳ－ＰＡＧＥ）鉴定，证实为ＩｇＧ纯品。再经ＴＳＨ偶联的亲和层析柱为免疫吸附剂，进一步分离出抗ＴＳＨＩｇＧ，然后用放射免疫分析（ＲＩＡ）检测证实保持了较高的抗体活性。     

一种简易制备白蛋白纯品及抗血清的方法──凝胶切割制备法

利用凝胶切割纯化法得到免疫纯人血清白蛋白（ＡＬＢ），经聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＣ）电泳确认为单一带，经ＳＤＳ－ＰＡＣＥ确定其相对分子质量为６７４６２．８０Ｕ，与Ｓｉｇｍａ纯品ＡＬＢ及日本产羊抗人ＡＬＢ抗血清免疫双扩散融合试验验证其为纯品ＡＬＢ。利用得到的ＡＬＢ免疫绵羊制备羊抗人白蛋白抗血清，与日本产品比较，为单价特异性抗血清。     

链霉亲和素的鉴定

作者在前阶段链霉菌的培养及其链霉亲和素（ＳＡ）分离纯化的基础上，对ＳＡ的生物学特性和理化性质作了测症。测得ＳＡ的分子量为７２８８１，等电点为６．０；经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳出现２条带，结合生物素的活性为１８μｇ／ｍｇ。从１升链霉菌培养液中可提取纯ＳＡ２３．２ｍｇ。     

一种简易制备白蛋白纯品及抗血清的方法——凝胶切割制备法

利用凝胶切割纯化法得到免疫纯人血清白蛋白（ＡＬＢ），经聚丙烯酰胺凝胶（ＰＡＣ）电泳确认为单一带，经ＳＤＳ－ＰＡＣＥ确定其相对分子质量为６７４６２．８０Ｕ，与Ｓｉｇｍａ纯品ＡＬＢ及日本产羊抗人ＡＬＢ抗血清免疫双扩散融合试验验证其为纯品ＡＬＢ。利用得到的ＡＬＢ免疫绵羊制备羊抗人白蛋白抗血清与日本产品比较，为单价特异性抗血清。     

大蒜超氧化物歧化酶的纯化

采用二次丙酮沉淀法和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶柱及ＤＥＡＥ－５２离子交换柱分离工艺纯化了大蒜铜锌超氧化物歧化酶。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测得其分子量为３２９３４ｕ（３３２００Ｄａｌｔｏｎ），产品达电泳纯。该酶在２５８ｎｍ处呈最大吸收，对氰化物、过氧化氢敏感。     

两种果子狸血清IgG纯化方法的比较

目的探讨一种具有简便快捷、高纯度、活性好的果子狸血清IgG纯化方法。方法比较Hitrap Protein A亲和层析和PAGE电泳两种纯化法对果子狸血清IgG的纯化,用PAGE还原电泳和Western-Blot法对IgG作纯度鉴定。结果对Hitrap Protein A纯化的果子狸血清IgG,其活性虽好,但纯度不高;而非还原PAGE电泳所纯化的果子狸血清IgG不但纯度高(>95%)、并具有较强的免疫活性。结论非还原PAGE电泳法纯化果子狸血清IgG,是一种具有高纯度、免疫活性强的纯化方法。     

斑点热群立克次体中国新分离株结构多肽的分析

本文用SDS—PAGE法分析了7个斑点热群立克次体国际标准株和5个斑点热群立克次体中国新分离株的结构蛋白,蛄果表明:7个斑点热群立克次体国标准株的结构蛋白除康氏立克次体Malish7株和India株蛋白图谱一致外,其余各株图谱各不相同。5个斑点热群立克次体中国新分离株的蛄构蛋白除BJ—90株和BJ—93株蛋白图谱一致,IM—TO—85株与国际标准株西伯利亚246株一致外,其余各株图谱各不相同。上述结果提示:结构蛋白图谱可以作为斑点热群立克次体的一个分类依据。     

银屑病患者指甲、鳞屑SDS-电泳图谱和转谷氨酰胺酶活性的探讨

目的探讨银屑病患者指甲、鳞屑SDS-电泳图谱和转谷氨酰胺酶活性(Transglutaminase 1,TGase 1)。方法取5例银屑病患者的指甲、鳞屑与5例健康者指甲、鳞屑,分别提取蛋白质进行SDS-PAGE(聚苯乙烯胺凝胶电泳)。应用HRP-单丹酰尸胺结合物对鳞屑铺片标本检测TGase 1酶活性。结果健康者指甲和鳞屑的SDS-电泳图谱皆呈现4条主带:63kDa,54kDa,48kDa及38kDa,银屑病患者指甲及鳞屑的SDS-电泳图谱也呈现以上4条主带,但多数主带扫描数值水平较高,P<0.05。健康者的鳞屑铺片标本TGase 1酶活性呈现棕黄色细颗粒,定位于角质深层角质形成细胞(keratinocyte,KC)的周缘,相比之下银屑病患者的TGase 1酶活性缺乏。结论指甲及鳞屑的SDS-PAGE电泳主带相似,前者图谱更清晰,可能与其蛋白较稳定有关;银屑病患者比健康者的SDS-电泳图谱主带表达水平高,提示其KC可能呈增生状态,表达产物较多;患者TGase 1酶活性的缺如提示其表皮屏障功能有缺陷,可能与其参与代偿性增生有关。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的表达改良型TAT-VP3融合蛋白,并对其进行纯化.方法利用IPTG温控诱导改良型TAT-VP3融合蛋白表达,并经GST亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western bolt鉴定.结果改良型TAT-VP3融合蛋白经温控诱导后得到稳定表达,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量42 kD的特异性目的条带,经GST亲和层析纯化后,得到了纯度较高的目的蛋白.Western bolt验证了表达蛋白的特异性.结论已成功表达及纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,为进一步研究其免疫原性和抗肿瘤活性奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化

目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg·mL^-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。     

人胎儿血红蛋白的纯化及免疫活性鉴定

目的研究胎儿血红蛋白纯化的最佳方法,并对其进行免疫活性鉴定。方法采用生理盐水洗涤、四氯化碳萃取得到粗提胎儿血红蛋白,再经sephadexG50凝胶层析柱纯化。纯化后的胎儿血红蛋白利用SDS—PAGE电泳、蛋白质印迹鉴定其性质。结果获得了具有生物活性的胎儿血红蛋白．经SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白杂带消失,蛋白单体相对分子质量为16000Mr,纯度为95％,蛋白质印迹结果显示纯化后的蛋白具有良好的抗原性。结论该方法成功获得了纯度较高的胎儿血红蛋白,且操作简便,纯化效果好。     

非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白的分离纯化

目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,优化Hap。蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在280nm波长处的光吸收值（D280）,用折线图显示,SDS-PAGE电泳检测分布图中处于峰值的样品,观察目的蛋白条带的出现。结果弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,缓冲液l洗脱液的D280分布为基线,缓冲液2洗脱液的D280分布折线图中有峰值出现,但峰有拖尾,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰主要为低分子量的蛋白条带;五种不同离子强度的缓冲液3洗脱液在100mmol／L NaCl离子强度时,D280的分布折线图显示有较高洗脱峰出现,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰有较明显的110000D的目的条带,其余离子强度下均未见明显洗脱峰出现。结论Sepharose CM FF层析柱分离纯化Haps蛋白质片段时,不同pH值的缓冲液对目的蛋白的洗脱没有明显影响,而主要影响杂蛋白的洗脱;100mmol／L NaCl离子强度的缓冲液3洗脱液获得较好的洗脱效果。     

纯化内耳P0蛋白诱发听神经脱髓鞘的实验研究

目的用从豚鼠内耳组织中纯化的P0蛋白免疫大鼠,观察实验动物听神经髓鞘变化,推测P0蛋白在听神经病的发生发展中的作用。方法采用SDS-PAGE从内耳组织中分离、纯化P0蛋白,用Western Blot法鉴定纯化的P0蛋白。用纯化的P0蛋白作为抗原免疫大鼠,观察其听性脑干反应阈、耳声发射的变化、动物血清IgG水平以及听神经的髓鞘在光镜电镜下的形态学变化,免疫组织化学技术观察P0蛋白在听神经上的分布。结果免疫后实验组大鼠听力学显示听神经病的特征：耳声发射正常,而听性脑干反应严重异常;实验组血清IgG水平显著升高。电镜下可见听神经的脱髓鞘病变,免疫组织化学技术显示P0分布在蜗神经纤维的髓鞘上。结论P0蛋白作为抗原能诱发蜗神经的脱髓鞘病变,可能是听神经病的重要发病机制之一。     

王棕花粉变应原的分析与鉴定

目的对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉(Roystonea regia pollen)变应原蛋白进行分离、分析与鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供基础。方法取常规方法制备的王棕花粉浸出液,采用SDS-PAGE分离王棕花粉蛋白质组分,测定其相对分子量,同时用10例对王棕花粉过敏的患者血清作Western-blot鉴定其变应原及主要变应原成分。结果SDS-PAGE显示王棕花粉有10条可辨蛋白带,其中主要条带有8条,分别为100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000和14000Mr,Western-blot结果表明,10例王棕花粉过敏患者血清全部呈阳性反应,有66000、24000、16000和14000Mr共4条致敏条带,其中分子量在16000和14000Mr的蛋白为主要变应原。结论王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

人骨肉瘤OS-732单克隆抗体的制备及纯化

目的制备、纯化抗人骨肉瘤OS-732单克隆抗体。方法通过杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,ProteinA-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单抗,SDS-PAGE、免疫组化及ELISA检测该单抗的性质。结果SDS-PAGE鉴定单抗纯度达到93%,ELISA检测抗体免疫活性效价为1×10-7。结论制备、纯化了具有较高纯度及生物活性的的抗骨肉瘤OS-732单克隆抗体,为下一步骨肉瘤靶向治疗打下了基础。