N末端的缺失对牙龈卟啉单胞菌FtsZ体外聚合的影响

目的:探讨N末端的缺失对牙龈卟啉单胞菌FtsZ体外聚合的影响.方法:将质粒pEZ1(PgFtsZ,携带野生型牙龈卟啉单胞菌FtsZ的基因)、pYWN1(ZΔN01, 携带PgFtsZ 的N末端去除了43个保守性氨基酸残基的缺失变异型PgFtsZ的基因)和pYWN2(ZΔN02, 携带PgFtsZ 的N末端去除了205个保守性氨基酸残基的缺失变异型PgFtsZ的基因)分别导入Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中表达,通过IPTG诱导表达目的蛋白质,6 mol/L尿素变性及HiTrap SP层析柱纯化目的蛋白质,最后通过沉淀法检测10 mmol/L的MgCl2、CaCl2和MnCl2对PgFtsZ、ZΔN01和ZΔN02体外聚合的影响.结果:10 mmol/L的MgCl2、CaCl2和MnCl2均能诱导PgFtsZ和ZΔN01出现聚合反应,然而10 mmol /L的MgCl2和CaCl2没能引起ZΔN02的体外聚合,而仅有10 mmol /L的MnCl2能诱导ZΔN02出现聚合反应,但效果不如PgFtsZ和ZΔN01明显.结论:PgFtsZ的N末端的43个氨基酸残基对Mg2+、Ca2+和Mn2+诱导其体外聚合反应影响不大,而后的162个氨基酸残基在PgFtsZ的体外聚合过程中起着关键的作用.     

阳离子诱导牙龈卟啉单胞菌FtsZ的聚合

在细菌细胞分裂过程中 ,一系列的相关蛋白质参与这一过程 ,其中FtsZ(filamentoustemperature sensitiveproteinZ)通过在未来细菌细胞分裂的中点处聚合成FtsZ环发挥着极其重要的作用。在本实验中 ,我们探讨了牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)的FtsZ(PgFtsZ)的体外聚合特性 ,以期为研制和开发干扰Pg菌细胞分裂的抗菌剂奠定实验基础。1.材料和方法 :(1)PgFtsZ的C末端缺失变异型质粒 pYW 1和 pYW 4在以前的实验中构建。(2 )PgFtsZ的N末端缺失变异型质粒的构建 :使用相同的downstream引物和两个不同的upstream引物 ,通过PC…     

黄芩对牙龈卟啉单胞菌生长、形态影响的体外实验

目的：探讨黄芩在牙髓、根尖周病治疗中的基础理论。方法：采用试管两倍稀释法测定黄芩对牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）；用扫描电镜观察低于MIC的3个浓度的黄芩对牙龈卟啉单胞菌形态的影响。结果：黄芩对牙龈卟啉单胞菌MIC值为1mg/mL；黄芩改变了牙龈卟啉单胞菌菌体的正常形态。结论：黄芩对牙龈卟啉单胞菌的生长、形态有抑制作用。     

牙龈卟啉单胞菌膜泡诱导牙龈上皮细胞炎性反应的体外研究

目的建立牙龈卟啉单胞菌膜泡诱导牙龈上皮细胞炎性反应的体外模型，探讨牙龈卟啉单胞菌在牙周炎中的致病作用。方法用酶联免疫吸附法检测牙龈卟啉单胞菌膜泡对牙龈上皮细胞前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）分泌的影响，以实时反转录聚合酶链反应法检测牙龈卟啉单胞菌膜泡对牙龈上皮细胞环氧化物酶（cyclooxygenase，COX）-2和白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8基因表达的作用。结果牙龈卟啉单胞菌膜泡浓度依赖性地促进了牙龈上皮细胞PGE2的分泌，并使COX-2、IL-6、IL-8的mRNA表达水平显著上调。结论牙龈卟啉单胞菌膜泡诱导牙龈上皮细胞发生的细胞炎性反应，可能是牙周炎发生、发展的重要因素。     

牙龈卟啉单胞菌研究进展

牙周炎是常见的口腔疾病之一,是中国成年人失牙的主要原因.牙龈卟啉单胞菌在引发牙周组织破坏过程中发挥着重要的作用,成为国内外学者研究的热点之一.本文就牙龈卟啉单胞菌与口腔疾病和其他全身性疾病的关系、牙龈卟啉单胞菌全基因组,牙龈卟啉单胞菌与牙龈上皮细胞的相互作用等研究作一综述,以拓宽牙龈卟啉单胞菌的研究思路,进血为牙周炎的...     

牙龈卟啉单胞菌Gingipains及抑制剂研究进展

牙龈卟啉单胞菌与成人牙周炎的起始和进展密切相关,其分泌的Gingipains(牙龈素,亦称半胱氨酸蛋白酶)是主要的毒性因子之一。本文就近年来对Gingipains及其抑制剂的研究进展进行综述。     

牙龈卟啉单胞菌与冠心病

牙周病是引起冠心病的危险因素之一,牙龈卟啉单胞菌是引起牙周病的主要致病菌,它可以侵入血管内膜导致血管壁增厚及释放内毒素,释放细胞因子促进血小板的聚集,血栓形成,从而导致心血管疾病的发生。     

牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化

大量流行病学证据已经证实牙周病和动脉粥样硬化存在一定的相关性,目前的研究主要偏向于牙周病在动脉粥样硬化病因中的作用机制,牙周病的病原体如牙龈卟啉单胞菌是否为动脉粥样硬化的病原体尚不清楚.本文对牙龈卟啉单胞菌在动脉粥样硬化发生、发展过程中所起的作用作一综述.     

牙龈卟啉单胞菌侵入牙龈上皮细胞的分子机制

牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌,牙龈上皮细胞是宿主牙周组织防御机制的第一道天然屏障。牙龈卟啉单胞菌可通过特异性粘附素与牙龈上皮细胞相应配体结合,激活该细胞内多种信号传导途径,最终内化于牙龈上皮细胞。内化后可通过某些细胞因子的合成和分泌减少以及抑制细胞凋亡等机制造成该细胞功能紊乱。本文从分子水平对牙龈卟啉单胞菌侵入牙龈上皮细胞的机制作一综述,以进一步阐明牙龈卟啉单胞菌的致病机理。     

牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关基因的克隆及表达纯化

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法 通过聚合酶链反应（PCR）克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pETpgn0523 pETpgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×10³、39.9×10³、66.0×10³的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·mL^-1。结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。     

大鼠实验性牙周炎中牙龈卟啉单胞菌rgpB和kgp变化的研究

目的:通过建立大鼠实验性牙周炎模型,检测不同时段大鼠上颌第一磨牙龈下人工定植的牙龈卟啉单胞菌、牙龈素rgpB和kgp相对含量的改变,动态观察牙周炎发展不同阶段牙龈卟啉单胞菌致病基因的变化。方法:选择6周的成年雄性大鼠13只,应用钢丝结扎法和细菌种植法建立大鼠实验性牙周炎模型。分别在4周和8周取上颌第一磨牙龈下菌斑,提取细菌DNA,应用PCR方法进行牙龈卟啉单胞菌、牙龈素基因rgpB和kgp特异引物扩增,应用SPSS13.0统计软件,分析大鼠牙周炎不同时段rgpB和kgp的相对变化。结果:大鼠实验性牙周炎模型,龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的相对含量实验组明显高于对照组,8周组高于4周组;实验组牙龈卟啉单胞菌牙龈素rgpB和kgp明显高于对照组,4周组和8周组rgpB和kgp相对含量无显著性差异。结论:rgpB基因和kgp基因与牙周炎的致病性有关而与牙周炎的严重程度可能无直接相关。     

Polymerase Chain Reaction Analysis of the Clonality of Porphyromonas Gingivalis and Collagenase Gene

目的：本研究旨在分析牙龈卟啉菌基因型和其重要毒力因子胶原酶基因（collagenase gene,PrtC）的遗传异质性，了解细菌遗传变异与其对牙周致病性的相关性。方法：采用随机引物聚合酶链反应（AP－PCR）的方法，对从24例牙周炎患者口腔中分离的79株牙龈卟啉菌和参考菌株ATCC33277进行DNA指纹分析。并随机选择24株临床菌株，进一步检测是否存在特异性的胶原酶基因片段。对照菌株为伴放线放线标菌Y4和中间普氏菌ATCC25611，通过酶切鉴定和DNA序列分析，了解PrtC基因遗传多样性的变化。结果：80株牙龈卟啉菌共获得7种基因型（I－Ⅶ），以Ⅶ所占比例最高（25．8％）。24株临床菌株和ATCC33277中均扩增出特异性的胶原酶基因片段（548bp）。将4株细菌的序列分析结果与国外的报道相比较，发现一些基因序列存在差异，其中有6个核苷酸碱基缺失。结论：临床分离的牙龈卟啉菌中可检测到多种基因型，存在明显的个体差异，这些菌株具有合成胶原酶的能力，不同菌株胶原酶基因之间存在遗传异质性的变化。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 ,为后续研究奠定了基础     

不同牙周状态下龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因差异研究

目的：探讨不同kgp基因型P.gingivalis在慢性牙周炎发生发展中的作用。方法：选择不同牙周状态下的龈下菌斑样本104个,根据kgp—cd基因序列的不同用限制性片断长度多态性分析的方法将P．gingivalis分为4个基因型。结果：慢性牙周炎患者病变重部位和病变轻部位检出率最高的分别为kgpcdⅡ型（56．25％）和Ⅰ型（51．72％）,对照组仅检出kgp--cdJ型（25％）和Ⅲ型（75％）。结论：kgpcdⅡ型P．gingivalis可能与慢性牙周炎的关系最密切,在致病过程中起主要作用,而kgp—cdⅠ型可能与慢性牙周炎无关,为健康人群或牙周健康部位的定置菌。     

二价金属阳离子对牙龈卟啉单胞菌FtsZ的GTPase活性的调控及意义

目的：探讨二价金属阳离子对牙龈卟啉单胞菌FtsZ的GTPase活性的影响。方法：将质粒pEZ1(Wt PgFtsZ，野生型PgFtsZ)、pYW1(ZΔC01，PgFtsZ的C末端缺失73个氨基酸残基的变异型)和pYW2(ZΔC02，PgFtsZ的C末端缺失128个氨基酸残基的变异型，已去除了PgFtsZ的C末端非保守性的区域)导入Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中表达，然后进行分离和纯化这些目的蛋白。使用Malachite green assay法，检测10mM／L的各种二价金属阳离子对纯化的WtPgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02的GTPase活性的作用。结果：二价金属阳离子对Wt PgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02的GTPase的活性作用的特性相似，既在10mM／L的Mg^2 存在下与没有Mg^2 的情况下它们的GTPase的活性相似；然而，在10mM／L的Ca^2 、Mn^2 、CO^2 和Ni^2 存在的情况下WtPgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02的GTPase的活性表现出不同程度的减弱(36．7％～70．8％)。结论：10mM／L的Mg^2 对WtPgFtsZ、ZΔC01和ZΔC02的GTPase的活性无影响，而10mM／L的Ca^2 、Mn^2 、CO^2 和Ni^2 则具有抑制作用。     

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K活性与青春期龈炎的临床相关性

目的：检测并比较青春期龈炎患者的龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K（Kgp）的活性,探讨Kgp在青春期龈炎中的临床意义。方法：受试对象为36例14～17岁青春期龈炎患者,检测并记录受检者的各牙周临床指标GI、SBI、PD的测值,取龈下菌斑进行P.gingivalis的分离培养,16S rRNA聚合酶链反应（PCR）法鉴定。将P.gingivalis临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用N-p-硝基苯胺乙酸盐分析Kgp的氨基酸溶解活性。采用SPSS11.0软件包,分泌蛋白与菌体蛋白的Kgp活性比较用t检验;Kgp活性与各牙周临床指标之间的相关关系用秩相关检验分析,P〈0.05具有显著性差异。结果：青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白中Kgp的活性高于菌体蛋白（P〈0.01）,Kgp的活性与GI、SBI、PD之间有正相关关系,统计学上有显著性差异（P〈0.05）。结论：Kgp酶活性的高低与青春期龈炎的严重程度有关。     

牙龈卟啉菌表面相关物质的提取、纯化及骨吸收和免疫特性研究

目的 :通过对牙龈卟啉菌Pg表面相关物质 (SAM)的提取、纯化 ,研究其潜在的骨吸收活性 ,以揭示pg的SAM在牙周病过程中的致病作用。方法 :1)细菌培养。 2 )SAM粗品的制备。Sephacryl-S2 0 0凝胶过滤、冻干、纯化。3)DEAE -Sephacel阴离子交换层析。 4 )SAM介导的小鼠颅骨吸收试验。结果 :1)细菌培养得到冻干的细菌 4 .1g。2 )分离SAM得到粗品 0 .16g。Sephacryl -S2 0 0凝胶过滤纯化SAM粗品 ,冻干后得到较纯的SAM约为 0 .0 2 2 1g。DEAE -Sephacel阴离子交换层析进一步纯化SAM获得SAM纯品 3mg。 3)纯化的SAM骨吸收活性鉴定。骨吸收作用可通过体外小鼠颅骨培养基中Ca2 + 浓度的增加而间接证实。SAM的骨吸收活性随着浓度的增加而增加 ,与对照组相比 ,P <0 .0 5。SAM具有免疫原性。结论 :SAM在骨吸收方面具有极大的潜能。提示SAM在牙周病骨损害方面起到重要的作用     

牙髓源性牙周牙髓联合病变牙周袋内牙龈卟啉单胞菌定量PCR检测

目的 比较牙髓源性牙周牙髓联合病变与重度慢性牙周炎患牙牙周袋内牙龈卟啉单胞菌的数量差异,为临床诊断牙髓源性牙周牙髓联合病变提供科学依据.方法 采集牙髓源性牙周牙髓联合病变、重度慢性牙周炎牙周袋内的龈下菌斑及正常人群龈沟液标本,应用实时定量PCR法检测牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)数量.结果 3组标本中Pg检出率差异无统计学意义;Pg数量差异有统计学意义.牙髓源性牙周牙髓联合病变中Pg数量显著性低于重度慢性牙周炎患牙(P<0.01),与正常人群Pg数量差异无统计学意义.结论 牙髓源性牙周牙髓联合病变中Pg数量低于重度慢性牙周炎患牙,与正常人龈沟液内的水平一致,Pg数量有可能作为鉴别牙髓源性与牙周源性牙周牙髓联合病变的指标.     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌在青春期龈炎患者中的分布

目的:分析不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在青春期龈炎患者和青春期牙周健康者中的分布。方法:收集51例青春期龈炎患者和46例青春期牙周健康者的龈下菌斑,采用16SrRNA PCR检测P.gingivalis,并根据各fimA基因型的特异引物,用PCR检测不同fimA基因型菌株的分布。结果:龈炎组各fimA基因型P.gingivalis的总检出率:Ⅰ型34.2%,Ⅱ型55.3%,Ⅳ型18.4%,Ⅲ型和Ⅴ型未检出;另有7例(占18.4%)未分出型别。健康组各fimA基因型P.gingivalis的总检出率:Ⅰ型14.3%,Ⅱ型85.7%,Ⅲ型14.3%,Ⅳ型28.6%,Ⅴ型未检出;另有2例(占14.3%)未分出型别。结论:青春期龈炎和青春期牙周健康者龈下菌斑中的P.gingivalis存在fimA基因多态性。fimA基因Ⅱ型是其主要存在的基因型,其次是Ⅰ型和Ⅳ型,Ⅲ型和Ⅴ型较少或不能检出。     

牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞LOX-1 mRNA表达的影响

目的研究牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）感染对血管内皮细胞（vein endothelial cell,VEC）血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1）mRNA表达的影响。方法建立P.g感染VEC的体外模型,采用Real Time-PCR技术检测P.g381菌株感染人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞株EA.hy926不同时间后,LOX-1 mRNA表达的变化。结果 P.g381侵入HUVEC促进LOX-1 mRNA的表达,与对照组相比较（△Ct值为3.78±0.16）,2 h时开始升高（△Ct值为3.60±0.33,P=0.240）,8 h达高峰（△Ct值为2.72±0.35,P=0.000）,12 h后显著回落（△Ct值为3.22±0.17,P=0.001）,至24 h时恢复至最初水平（△Ct值为3.65±0.24,P=0.390）。结论 P.g感染促进HUVEC表达LOX-1 mRNA。