结核菌抗原基因Rv3881c在大肠杆菌中的高效表达分析

目的：从结核分枝杆菌基因组克隆Rv3881c基因并重组入pET24b载体，在大肠杆菌中进行融合表达。重组蛋白经纯化后通过Western blot分析初步鉴定其抗原性和特异性。方法：提取H37Rv标准株的基因组DNA。以基因组DNA为模板PCR扩增出Rv3881c基因，连接到pGEMT上。经过筛选鉴定后。将重组子测序；将测序正确的基因双酶切后连接到pET24b载体上，筛选得到重组载体pET24b-48；在BL21菌株中优化表达并采用金属鏊合层析方法纯化蛋白：选取6例结核病阳性临床血清标本和6例健康人血清标本进行Western blot分析。结果：发现从保存的H37Rv菌株克隆得到了读码框完全正确的Rv3881c基因。它在大肠杆菌中可以高效表达。表达量约占细菌总蛋白的20％以上。重组蛋白不与健康人血清反应。可与结核标本血清有较强的免疫印迹反应。结论：重组Rv3881c具有较好的特异性。该抗原有潜力成为检测结核的有效抗原组分之一。     

结核分枝杆菌Rv0444c基因的克隆、表达及ELISA检测

目的：探索结核分枝杆菌Rv0444c基因编码的蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法：首先克隆了结核分枝杆菌Rv0444c蛋白的编码基因，构建了pET30a—Rv0444c重组质粒，并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中，测序鉴定结果正确。将pET30a—Rv0444c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，表达纯化目的蛋白并做质谱分析。制备Rv0444c蛋白的多克隆抗体，纯化的重组蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测．结果：重组抗原在检测耐药肺结核病人中的检出率为41．6％（25／60），特异性为90％。结论：为后续深入研究Rv0444c蛋白的生物功能、研究其作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础．     

结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌抗原Rv0173的克隆、表达与纯化

目的 在大肠杆菌中表达、纯化结核分枝杆菌Rv0173抗原,为研制新型结核病疫苗打下基础.方法 将结核杆菌抗原Rv0173的全长cDNA插入到原核表达载体pGES-4T-1中,构建成Rv0173重组质粒.将重组质粒转入大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白.结果 获得了pGEX4T-Rv0173 重组子,Rv0173蛋白在BL21菌中获得表达,表达的蛋白条带大小约45KD,与预期结果相符.结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Rv0173进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶GST融合表达载体的构建及表达

目的构建间日疟原虫乳酸脱氢酶（PvLDH）融合表达载体,并表达PvLDH的GST融合蛋白。方法将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PvLDH/pGEX-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和间日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应。结论间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

重组人粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的表达

背景：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（humangranulococyte—macrophage colony stimulating factor，hGM—CSF）是刺激造血前体细胞分化及增殖的细胞因子，同时在机体免疫调节过程中具有重要作用。大肠杆菌表达系统所具有的低成本、高产量等优点则是其他体系无法比拟的，因此仍是目前最常用的外源基因表达系统。目的：观察重组人粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的表达。设计、时间及地点：观察性实验，于2007—02／06在三峡大学生物技术研究中心实验室完成。材料：质粒pBR322hGM—CSF购自美国ATCC菌种保藏中心。hGM—CSF抗体购自Sigma公司，IPTG、X—ga1和载体pMGT-18，购自上海生物工程技术公司。方法：根据hGM—CSF基因序列设计出引物，以克隆载体质粒pBR322-hGM—CSF为模板，得到hGM．CSF基因并重组入原核表达载体pGEX4T-1中，将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH5a，用IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE鉴定并用Western bloting检测。主要观察指标：hGM．CSF在大肠杆菌中的表达。结果：SDS，PAGE显示，得到相对分子量为40500的目的蛋白，表达量可达菌体总蛋白的17．9％。Western bloting检测表明，抗hGM—CSF单抗可与相对分子量为40500大小的电泳条带发生特异性反应。结论：实验构建了原核表达载体pGEX—hGM—CSF，并在大肠杆菌中诱导表达，得到hGM—CSF融合蛋白。     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

Contribution of the Rv2333c efflux pump (the Stp protein) from Mycobacterium tuberculosis to intrinsic antibiotic resistance in Mycobacterium bovis BCG

OBJECTIVES: To characterize the efflux pump encoded by the gene Rv2333c from Mycobacterium tuberculosis, and assess its contribution to intrinsic antibiotic resistance using Mycobacterium bovis BCG as a model organism. METHODS: Firstly, the Rv2333c gene was expressed from a multicopy plasmid in M. bovis BCG. Secondly, the gene was inactivated in the chromosome of M. bovis BCG. Antibiotic susceptibility tests and tetracycline uptake/efflux experiments were carried out with the strains mentioned above. RESULTS: When the Rv2333c gene was inactivated in the M. bovis BCG chromosome, there was a decrease in the MIC values of spectinomycin and tetracycline, and an increase in [3H]tetracycline accumulation. When the Rv2333c gene was cloned into a multicopy plasmid, there was an increase in the MIC values of spectinomycin and tetracycline, and a decrease in [3H]tetracycline accumulation. These results indicate that both antibiotics are substrates of the Rv2333c efflux pump, which has been named Stp, for Spectinomycin Tetracycline efflux Pump. CONCLUSIONS: The Rv2333c efflux pump (Stp protein) of M. tuberculosis contributes to intrinsic spectinomycin and tetracycline resistance.     

单纯疱疹病毒2型全长糖蛋白D抗原的原核表达及抗原性分析

目的:构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)全长糖蛋白D(gD)基因原核表达质粒,研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达,并鉴定重组蛋白的gD抗原性。方法:提取病毒DNA,PCR扩增出gD基因,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠杆菌BL21。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后,IPTG诱导表达融合蛋白GST-gD,并进行免疫学鉴定。结果:获得了gDDNA。测序鉴定表明,该序列与Gen Bank中的序列一致,gD基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD经IPTG诱导后能在大肠杆菌中高效表达,Western Blotting证实,该蛋白具有天然gD抗原性。结论:成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD,在大肠杆菌中获得了有效表达,并证实融合蛋白具有gD免疫原性。为进一步研究gD蛋白的免疫学特性,制备gD亚单位疫苗和单克隆抗体奠定了基础。     

幽门螺杆菌标准株NCTC11639 HSPA基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)热休克蛋白A(heatshockproteinA,HSPA)编码基因的重组质粒,测定、分析其核酸序列,并在E.coli中表达,研究其抗原性。方法:应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增HSPA编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其他Hp菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上进行表达和纯化,用Westernblot检测产物的抗原性并用ELISA法对29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体进行鉴定。结果:HSPA基因全长351bp(GenBank登录号为DQ141574),核酸同源性为96%～98%,表达的HSPA融合蛋白分子量约为41ku,表达产物可被Hp感染患者血清识别,29株抗小鼠Hp全菌单克隆抗体中有4株是针对HSPA抗原的。结论:重组HSPA具有较好的抗原性,为Hp疫苗的研究奠定基础。     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.