结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性研究

目的 研究结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性.方法 用原核表达的Rv1009结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次.每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数.ELISA方法检测淋巴细胞悬液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-10和IL-12的产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果 Rv1009结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1:12 800.淋巴细胞增殖指数为2.40±0.18,明显高于生理盐水对照组的0.90±0.21.ELISA方法检测Rv1009结构域多肽免疫组IFN-γ、IL-10和IL-12水平为(1432±30)ng/L、(503±11)ng/L和(311±11)ng/L,显著高于生理盐水对照组的(256±20)ng/L、(76±6)ng/L和(56±8)ng/L(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rv1009结构域多肽免疫组小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为4.86±0.14,P<0.05),但不及BCG免疫组的3.81±0.16.结论 Rv1009结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核分枝杆菌CFP10和MPT48及TB8.4融合蛋白的表达与临床应用

目的 构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合蛋白,评价其用于结核病血清学检测的价值.方法 选取2008年上海市肺科医院肺结核患者150例,非结核肺部疾病患者70例,健康体检者103名,采集血清标本共323份.构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合表达载体.融合蛋白经免疫印迹分析后,采用酶联免疫吸附试验检测血清标本,运用Medcale11.5对结果进行统计学分析.结果 成功构建重组质粒pET21a-cfp10-mpt48-tb8.4,获得95％以上纯度的融合蛋白.免疫印迹法发现融合蛋白与血清抗体发生免疫反应.融合蛋白检测血清抗体敏感度56.7％(85/150),特异度90.8％(157/173),其中非结核病患者特异度为85.7％ (60/70),健康体检者特异度为94.2％(97/103).结论 CFP10-MPT48-TB8.4融合蛋白所具有的免疫反应性,有可能成为结核病血清学诊断的候选抗原.     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c表达与结核分枝杆菌耐药关系探讨

目的研究外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c的表达与结核分枝杆菌（MTB）不同耐药表型的关系。方法提取2017 — 2018年浙江省宁波市疾病预防控制中心耐药监测期间收集的102株MTB核糖核酸（RNA），应用实时荧光定量PCR方法检测ABC转运蛋白超家族外排泵基因Rv1456c、Rv1457c、Rv1458c的表达量，采用Mann-Whitney U检验分析外排泵基因表达在不同耐药表型菌株中的差异。结果Rv1457c和Rv1458c基因表达量在利福平耐药组中的中位数及四分位数间距［0.507（0.378 ~ 1.444），1.842（1.325 ~ 2.628）］高于利福平敏感组［0.418（0.357 ~ 0.618），1.545 （1.189 ~ 2.065）］，差异有统计学意义（Z＝2.030、2.108，均P＜0.05）。 耐多药组Rv1457c和Rv1458c基因表达量的中位数及四分位数间距［0.538（0.419 ~ 1.490），1.941（1.471 ~ 2.659）］，高于非耐多药组［0.415 （0.337 ~ 0.618），1.533 （1.122 ~ 2.056）］，差异有统计学意义（Z＝2.865、2.896，均P＜0.05）。 异烟肼耐药组和敏感组中Rv1456c、Rv1457c的高表达率均存在差异（χ2＝4.858、6.789，均P＜0.05），利福平耐药组和敏感组中Rv1456c的高表达率差异有统计学意义（χ2＝8.424，P＜0.05），链霉素耐药组和敏感组中Rv1457c的高表达率差异有统计学意义（χ2＝4.545，P＜0.05），乙胺丁醇耐药组和敏感组中Rv1456c、Rv1457c的高表达率差异均有统计学意义（χ2＝5.142、10.202，均P＜0.05）。结论外排泵基因Rv1457c、Rv1458c的相对表达量增加与MTB对利福平耐药有关。     

结核分枝杆菌Rv0444c基因的克隆、表达及ELISA检测

目的：探索结核分枝杆菌Rv0444c基因编码的蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法：首先克隆了结核分枝杆菌Rv0444c蛋白的编码基因，构建了pET30a—Rv0444c重组质粒，并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中，测序鉴定结果正确。将pET30a—Rv0444c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，表达纯化目的蛋白并做质谱分析。制备Rv0444c蛋白的多克隆抗体，纯化的重组蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测．结果：重组抗原在检测耐药肺结核病人中的检出率为41．6％（25／60），特异性为90％。结论：为后续深入研究Rv0444c蛋白的生物功能、研究其作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础．     

中国结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及其耐药性分析

目的 选用间隔区寡核苷酸分型方法对有中国代表性的菌株进行基因分型,研究不同基因型在中国的流行情况,并分析基因型与耐药表型的关系.方法 中国疾病预防控制中心于2007-2008年,按照流行病学抽样的原则从中国31个省收集涂片阳性的结核病患者的临床分离株4 017株,采用比例法进行药物敏感性实验,选用寡核苷酸分型方法对菌株进行基因分型.基因型检出率差异比较采用x2检验.结果 在4017株结核分枝杆菌临床分离株中,北京基因型菌株包括2 500株(62.2％).北方地区来源菌株北京基因型检出率达76.5％(1 913株),高于南方地区检出率(53.2％,1 330株),差异有统计学意义(x2=219.69,P＜0.05).南方地区T1型检出率达13.3％(332株),高于北方地区检出率(4.3％,108株),差异有统计学意义(x2=88.07,P＜0.05).北京基因型在耐利福平(21.7％)、耐氧氟沙星(4.9％)和MDR( 11.3％)的比例都高于非北京基因型的相应菌株比例18.4％、2.4％和7.4％,差异有统计学意义(x2值分别为22.10、14.42和14.83,P均＜0.05).结论 北京基因型目前仍然是中国主要流行基因型,并且比例呈现出地域差别,北方地区显著高于南方地区.北京基因型菌株与耐利福平、耐氧氟沙星和MDR有关.     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

结核菌抗原基因Rv3881c在大肠杆菌中的高效表达分析

目的：从结核分枝杆菌基因组克隆Rv3881c基因并重组入pET24b载体，在大肠杆菌中进行融合表达。重组蛋白经纯化后通过Western blot分析初步鉴定其抗原性和特异性。方法：提取H37Rv标准株的基因组DNA。以基因组DNA为模板PCR扩增出Rv3881c基因，连接到pGEMT上。经过筛选鉴定后。将重组子测序；将测序正确的基因双酶切后连接到pET24b载体上，筛选得到重组载体pET24b-48；在BL21菌株中优化表达并采用金属鏊合层析方法纯化蛋白：选取6例结核病阳性临床血清标本和6例健康人血清标本进行Western blot分析。结果：发现从保存的H37Rv菌株克隆得到了读码框完全正确的Rv3881c基因。它在大肠杆菌中可以高效表达。表达量约占细菌总蛋白的20％以上。重组蛋白不与健康人血清反应。可与结核标本血清有较强的免疫印迹反应。结论：重组Rv3881c具有较好的特异性。该抗原有潜力成为检测结核的有效抗原组分之一。     

氨基末端脑利钠肽的原核表达与纯化及稳定性研究

目的从构建了人氨基末端脑利钠肽（amino-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）基因的表达菌中抽取目的蛋白，并对其进行纯化、鉴定及稳定性的初步研究。方法取表达菌株BL21-pGEX-4T-3-NT-proBNP，IPTG诱导表达，GSH-agarose亲和纯化目的蛋白，提纯产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，并采用自动免疫分析仪检测其免疫反应性和稳定性。结果GST-NT-proBNP融合蛋白表达水平高，可溶性好。SDS-PAGE、免疫测定分析显示其相对分子量为34600，具有较高的特异免疫反应性和稳定性。结论NT-proBNP能通过基因工程手段以GST融合蛋白的形式大量获取，在非变性条件下得到的GST-NT-proBNP有较好的免疫反应活性和稳定性。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

结核分支杆菌Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3抗原的基因克隆、表达及在血清诊断中的应用

[目的]克隆Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3：二种结核分支杆菌抗原的基因，利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白，分析纯化并初步评价其抗原性。[方法]通过PCR方法从结核分支杆菌菌株H37Rv基因组中扩增Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3基因，连接入pBVIL1表达载体，在大肠杆菌菌株HB101中进行表达，蛋白纯化后通过间接ELISA方法初步评价其抗原性。[结果]获得了结核分支杆菌抗原Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3的基囚，并存大肠杆菌中进行了高效表达，初步验证所获得的纯化抗原具有良好的抗原性。[结论]通过pBVIL1表达载体高效表达的结核分支杆菌抗原Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

结核分枝杆菌H37Rv株菌体抗原及分泌抗原分析

目的 对比分析人型结核枝杆菌（结核菌）H37Rv株固体培养菌、液体培养菌及分泌蛋白中抗原成分的差异，寻找结核菌的主要免疫抗原。方法 应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、免疫印迹技术及单克隆抗体技术分析人型结核菌H37Rv株固体培养、液体培养及其分泌蛋白中的抗原成分。结果 固体培养菌与液体培养菌具有基本一致的多肽抗原成分，其主要成分分子量为79000、64000、54000、50000、28000～38000、23000等，而分泌蛋白差异稍大，其主要成分分子量为66000、63000～65000、55000、42000、32000～34000、24000、16000等。单克隆抗体进一步证明66000、55000、16000为分泌蛋白。多克隆抗体免疫印迹分析表明，菌体主要免疫原有79000、54000、38000～50000、28000蛋白成分，而分泌蛋白主要免疫原为分子量66000、55000～64000、30000～34000、24000、16000成分。结论 人型结核菌H37Rv株菌体蛋白和分泌蛋白具有不同的主要免疫原，将有助于认识H37Rv株的总体蛋白组成及寻找与结核病相关的特异性抗原成分。