大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

人胆固醇酯水解酶基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建含有人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因的慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH-IRES-EGFP,为hCEH基因治疗缺血性脑卒奠定基础。方法应用聚合酶链反应方法扩增目的片段,在目的基因进行上、下游分别加上PacI和AscI两个酶切位点,经双酶切后,转化入感受态DH5d细胞中,通过筛选获得重组质粒。将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果目的基因与慢病毒表达载体pLenti6．3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP构建与预期相匹配,包装细胞293T呈绿色荧光。结论成功构建了携带hCEH基因的慢病毒载体。     

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

大鼠瘦素受体RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

[目的]构建大鼠OBRb基因的RNAi慢病毒载体,并评估其对OBRb基因表达的沉寂作用。[方法]设计大鼠OBRb的siRNA靶序列,合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,退火后插入到慢病毒载体质粒pRNA-lentivector-VGFP上,构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;为了评估RNAi基因沉寂作用,将构建的慢病毒载体转染表达OBRb的C6大鼠神经胶质瘤细胞,利用Realtime PCR方法检测OBRb mRNA表达水平。[结果]将目的序列连接到慢病毒载体上,成功构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;通过PCR、电泳初步鉴定该重组体有OBRb表达,并进一步进行基因测序证实插入序列正确;成功将慢病毒载体转染到C6大鼠神经胶质瘤细胞,转染效率可达40%;荧光实时定量PCR检测OBRb基因表达量,结果干扰组的OBRb mRNA表达水平明显低于非干扰序列的对照组,可使OBRb mRNA表达量下调近80%。[结论]成功构建大鼠OBRb的RNAi慢病毒载体,为进一步的体内研究奠定了基础。     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为c DNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建p WPTS-m BTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA m RNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染p WPTS-m BTLA及p WPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠p WPTS-m BTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果 ,发现4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建LOX-shRNA的慢病毒表达载体及其病毒包装鉴定。方法 利用Oligo Designer 3.0,根据人LOX基因序列设计shRNA,并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入LOX表达载体中,构建shRNA表达质粒,并转化至E.coli TOP10感受态细胞,抽提质粒后进行测序。将重组质粒转染HEK-293T细胞,应用RT-PCR检测各组LOX基因mRNA的表达水平,筛选出最有效的LOX-shRNA后,通过LipofectAMINETM2000介导转染293T细胞,对慢病毒进行包装并测定慢病毒滴度。结果 利用慢病毒介导将重组质粒LOX-shRNA-3024高效转导入HEK-293T细胞并稳定表达。荧光显微镜显示,转染24h后,HEK-293T细胞即开始发出绿色荧光;72h后,有大量荧光表达,而对照组未转染质粒的HEK-293T细胞不表达,可见慢病毒载体被成功转染。LOX-3024重组慢病毒的滴度为2×10¹⁰TU/ml。结论 成功构建LOX-shRNA慢病毒表达载体,并稳定转染HEK-293T细胞,为研究LOX对人阴道壁成纤维细胞生物学行为的影响提供了实验基础。     

小鼠nNOS(AA1-133)基因慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建含nNOS(AA1-133)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能?方法:采用RT-PCR扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP/nNOS(AA1-133)?鉴定正确后将目的基因克隆入慢病毒载体pGC-FU,得重组载体pGC-FU/nNOS(AA1-133),采用Lipofectamine 2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒后感染原代神经元,检测目的片段的表达和功能?结果:成功扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,包装后的慢病毒颗粒可以感染神经元,目的片段可在神经元中表达并与PSD95结合?结论:慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,目的片段在原代神经元中可表达并发挥功能?     

MMP-9基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对小鼠MMP-9基因序列,利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,应用Western blot在293T细胞中鉴定MMP-9表达的下调作用。结果PCR鉴定和DNA测序结果显示合成的含MMP-9 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;构建的MMP-9RNAi慢病毒载体能够抑制MMP-9的表达。结论应用基因工程技术,成功构建了小鼠MMP-9基因RNAi慢病毒载体,为应用于在体基因治疗创造了条件。     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的: 构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法: 采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果: 重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论: 成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。     

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达

 目的 构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法 克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体（pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red）与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果 构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论 成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。