壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外表达的研究

目的研究壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外转染及表达。方法采用壳聚糖体外转染鼠成纤维细胞,对转染后72h的细胞应用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达。27只糖尿病大鼠随机分为3组(pCMV.INS组、pCMV组、生理盐水组),体内转染通过尾静脉注射糖尿病大鼠,检测空腹血糖和胰岛素。结果pCMV转染细胞无胰岛素表达,pCMV.INS转染大约10%的细胞有胰岛素表达;pCMV.INS转染大鼠血浆胰岛素显著高于生理盐水对照组(P<0.01)和pCMV对照组(P<0.01)。结论人胰岛素基因可通过壳聚糖直接转染至糖尿病大鼠体内发挥治疗作用及壳聚糖可能是一种很有前途的基因载体。     

糖尿病基因治疗的实验研究I.人胰岛素基因真核细胞表达…

为有效开展糖尿病基因治疗，作为第一步，本研究构建了人胰岛素原基因与表达载体ＰＲＣ／ＣＭＶ的重组体。首先，从质粒ＰＢＣＡ中酶切回收２６０ｂｐ的人胰岛素原基因片段，利用中间载体ＰＢＳ．ＳＫ构建了含人胰岛素原基因片段的过渡质粒ＰＢＳ．ＩＮＳ，在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体ＰＲＣ／ＣＭＶ．ＩＮＳ。     

糖尿病基因治疗的实验研究Ⅰ.人胰岛素基因真核细胞表达质粒的构建

为有效开展糖尿病基因治疗，作为第一步，本研究构建了人胰岛素原基因与表达载体PRC／CMV的重组体。首先，从质粒PBCA中酶切回收260bp的人胰岛素原基因片段，利用中间载体PBS．SK构建了含人胰岛素原基困片段的过渡质粒PBS．INS，在此基础上构建了真核细胞表达的人胰岛素基因重组体PRC／CMV．INS。     

人胰岛素原C肽基因高效表达载体的构建

目的：构建一种快速、高效的人胰岛素原C肽基因的表达载体，为有效地提高重组C肽的产量奠定了基础。方法：以人胰岛素原C肽的基因序列为基础，运用DNA重组技术构建出含5个拷贝的头到尾连接的C肽基因片段的高效表达载体。结果：通过酶切鉴定和DNA测序分析证实，实验成功地构建了人胰岛素原C肽基因的表达载体pMAL—C2E—C5.结论：人胰岛素原C肽基因表达载体pMAL—C2E—C5的成功构建，为进一步研究在大肠杆菌中表达人C肽融合蛋白，继而获得高产的单体C肽奠定了基础。     

人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定

目的:构建胰外表达成熟胰岛素的重组体.方法:将人胰岛素原基因进行二处突变,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体pLXSN重组并转染肝癌细胞.提取肝癌细胞基因组DNA,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况.同时测定成熟胰岛素的表达.结果:胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组.突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素.结论:成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体.     

基因重组人胰岛素和动物胰岛素治疗糖尿病的疗效比较

近年来许多研究表明，胰岛素不仅对治疗1型糖尿病治疗是必需的，而且对治疗2型糖尿病，越早使用胰岛素治疗亦显得十分重要。为观察人胰岛素诺和灵R和动物普通胰岛素治疗糖尿病的疗效和不良反应。我院2002年1月至2003年8月共收治2型糖尿病患者74例，现将观察结果报道如下。     

肌肉注射大鼠胰岛素原基因治疗糖尿病大鼠的研究

目的:研究肌肉注射大鼠胰岛素原基因重组表达质粒转基因治疗对糖尿病大鼠血糖和胰岛素分泌的影响.方法:链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠糖尿病模型,经肌肉注射将大鼠胰岛素原基因重组表达质粒pCMV/proinsulin DNA裸质粒直接导入糖尿病大鼠体内,与转染同等剂量pCMV空载质粒的对照组比较,观察糖尿病大鼠血糖的影响以及体内胰岛素表达的变化.结果:①接受肌肉注射重组质粒的治疗组(A组)糖尿病大鼠血糖下降约4 mmol/L,且能维持1～2周,血浆胰岛素水平明显升高,并持续表达2周;②肌肉注射胰岛素原基因治疗后,治疗组血糖明显低于接受pCMV空载质粒对照组(B组)和糖尿病对照组(DM组)(P＜0.05),治疗组胰岛素浓度也明显高于这两个对照组(P＜0.05);③肌肉注射治疗组大鼠的骨骼肌能检测到大鼠胰岛素原基因mRNA的表达,而对照组则为阴性;治疗组大鼠胰腺胰岛素原基因mRNA的表达量也明显高于对照组;④免疫组化结果显示,肌肉注射治疗组大鼠骨骼肌组织可见胰岛素表达,而对照组则无表达;治疗组胰腺组织胰岛素含量较对照组明显增高.结论:糖尿病大鼠裸质粒肌肉注射转基因治疗可获得胰岛素的有效表达,并有效降低糖尿病大鼠的血糖水平.     

重组人胰岛素基因质粒对糖尿病大鼠治疗效能的研究

目的通过本实验显示以逆转录病毒为载体糖尿病基因对糖尿病大鼠具有治疗效能,从而为该方法的临床应用进一步铺平道路。方法建立链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠模型,通过腹腔注入重组人胰岛素基因质粒,观察血糖和体重的控制情况及胰岛素的表达水平。结果通过腹腔注入含有人胰岛素基因的重组质粒组的血糖水平和体重较对照组均有明显改善,同时胰岛素分泌水平较对照组有明显提高。结论在动物实验中,通过腹腔注入含有目的基因的重组质粒对糖尿病大鼠具有治疗效能,通过胰岛素、血糖的水平和体重的变化来体现。此实验为下一步的临床实验做好铺垫。     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定

目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体 pLXSN中 ,测序正确后转染包装细胞PA317,经G4 18筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果　测序证明胰岛素原cDNA的 5个预定位点成功突变 ,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列 ;G4 18筛选重组pL mPIN SN转染PA317细胞抗性克隆 ,其病毒滴度为 2 .6× 10 5CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT PCR都显示有 2 86bp的条带 ,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论　成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系 ,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础     

胰岛素样生长因子-1基因表达对糖尿病大鼠血糖的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达对糖尿病(DM)大鼠血糖的影响。方法:将含人IGF-1基因的重组转运质粒pCMV/IGF-1 DNA每鼠400μg肌内注射于DM大鼠模型(T组,n=7)体内,对照组(C组,n=7)给予同等剂量pcMV空载质粒DNA,同时设立正常对照组(N组,n=7)和DM对照组(DM组,n=7)。观察大鼠血糖和血IGF-1浓度(ELISA法),用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法比较治疗前后大鼠肝、肾、骨骼肌等组织IGF-1 mRNA表达量变化。结果:ICF-1基因治疗后,T组血糖较治疗前明显下降,由(28.71±1.79)mmol/L至(17.02±1.69)mmol/L,同时血IGF-1较基础水平明显升高,由(109.34±10.90)ng/ml至(135.61±6.15)ng/ml;T组大鼠在接受治疗后,血糖明显低于C组和DM组(P<0.000 1),而血IGF-1明显高于C组和DM组(P<0.000 1);RT-PCR结果显示,T组大鼠肝脏和骨骼肌IGF-1 mRNA表达量明显高于DM组(P<0.000 1,P=0.002),肾组织IGF-1基因含量与DM组比较,无明显统计学差异(P=0.387)。结论:IGF-1基因表达能有效降低DM动物血糖,为开展DM治疗新策略奠定基础。     

hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达

 目的构建hPAK4真核表达载体,证实融合蛋白在细胞内表达,融合蛋白可以用于GST-pulldown实验。方法提取人乳腺癌细胞MCF-7mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有GST标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western
      blot检测,同时进行GST-pulldown实验。结果hPAK4全长基因序列克隆到真核表达载体pEBG中,酶切鉴定片段为1800bp。Westernblot检测到融合蛋白GST-hPAK4的表达,分子量约为94kDa,融合蛋白能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。结论成功构建了hPAK4全长基因真核表达载体,同时鉴定了GST-hPAK4融合蛋白的表达,并且能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。     

HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

  目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达?方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)mRNA,反转录为cDNA?PCR 扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体?转染HUVEC,Western blot 检测转染后HMGB1基因的表达改变?结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达?结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中     

基因芯片研究糖尿病肾病大鼠肾皮质基因表达

目的：研究正常与糖尿病肾病大鼠肾脏的基因表达谱,大规模分析糖尿病时基因表达水平的变化。方法：（1）实验大鼠分为两组,一组为正常对照组,另一组为糖尿病组;（2）从肾皮质中抽提mRNA,经反转录分别用Cy3,Cy5荧光标记,获得两组动物来源的cDNA探针;（3）cDNA探针与Biodoor基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果（1）18．4％的基因表达谱发生明显的变化,其中12条基因在糖尿病时表达量明显下降,而323条基因在糖尿 时表达量明显上升;（2）已报道基因占了差异表达基因总数的18．8％左右,大多数已报道基因在糖尿病时的表达模式与其他作者的报道类似。结论：利用基因芯片技术结合实验动物模型能大规模,高通是地研究糖尿病的基因表达谱,初步筛选出选出疾病相关基因,对进一步阐明疾病在基因水平上的发病机制有十分重要的作用。     

人重组胰岛素样生长因子-1对糖尿病大鼠肾脏的影响

目的观察人重组胰岛素样生长因子1(rhIGF-1)对糖尿病大鼠肾脏的影响。方法采用生化法、放射免疫法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术等方法。结果(1)糖尿病治疗组24h尿白蛋白排泄率和尿量低于糖尿病对照组;(2)糖尿病对照组血清IGF-1含量、肾组织IGF-1含量及IGF-1信使核糖核酸(IGF-1mRNA)表达明显低于正常对照组;糖尿病治疗组血清IGF-1含量明显高于糖尿病对照组,肾组织IGF-1含量及IGF-1mRNA表达与糖尿病对照组无明显差异;(3)糖尿病对照组血清生长激素(GH)高于正常对照组,糖尿病治疗组血清GH低于糖尿病对照组;(4)电镜观察大鼠肾脏病理切片发现rhIGF-1对糖尿病大鼠肾脏损害有改善作用。结论小剂量外源性rhIGF-1不会加重糖尿病肾脏的损害     

食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

人类白细胞介素2表达型基因重组子pRET—90的构建

应用基因重组技术,将人类白细胞介素2(IL-2)cDNA的440bp限制性内切酶片段(HgiAI-DraI)重组于T_7 promotor质粒pET 3d的Ncol克隆点,构建成表达型重组质粒pRET-90。