人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

含人乳头瘤病毒16型E6E7反意基因的假型逆转录病毒对人乳头瘤病毒16型转化细胞生长的抑制作用

构建了一个含人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７反意基因片断的逆转录病毒载体ｐＨ１９。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＨ１９导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，使之产生假型逆转录病毒Ｈ１９。Ｈ１９病毒感染人乳头瘤病毒１６型转化的细胞后，使转化细胞的生长速率和裸鼠体内形成肿瘤的能力均明显下降。     

人乳头瘤病毒E7蛋白生物活性研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)是一种小分子DNA病毒，其早期基因E7编码具有多种生物活性的E7蛋白。E7蛋白与腺病毒EIA及多瘤病毒SV40蛋白有相似的结构，可与pRB、P^53反应，改变宿主细胞G1／S期的转化。E7蛋白还能同多种细胞因子发生反应，影响宿主细胞代谢，直接导致宿主细胞中心体的变化。E7蛋白在HPV的致病性方面发挥重要作用。     

中国地方株人乳头瘤病毒16型E7基因一级结构及其变异

从湖北地区一宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，采取加端聚合链反应（Ａｄｄ－ｏｎ ＰＣＲ）技术，获得了人乳头瘤病毒１６型E７基因（ＨＰＶＩ６Ｅ７）。将该基因克隆于载体ｐＵＣ１８后，进行了该基因一级结构顺序分析。完整的ＨＰＶ１６Ｅ７湖北株基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）全长２９４ｂｐ，与已发表的德国株（ＧＳ）大小一致，但其核苷酸顺序中有２处发生了变异，均为Ｃ→Ｔ变异。第４３位ＣＡＡ→ＴＡＡ使相应的谷氨酰胺密码子变为终止密码，形成无义突变（Ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎ）。将重组质粒中０．３ｋｂ的ＨＰＶ１６Ｅ７基因在表达载体ＰＷＲ５９０－１中进行克隆，经诱导使重组表达质粒在大肠杆菌中高效表达，得到了预计的、分子量约为６９×１０~３的融合蛋白。该蛋白的表达量占菌体总蛋白量的３０％左右。该试验表明ＨＰＶ１６Ｅ７一级结构以及所编码的蛋白多肽在不同的国家和／或不同的地区可能存在着差异。本文首次报道了中国地方株ＨＰＶ１６Ｅ７基因的一级结构。     

人乳头瘤病毒16 E6蛋白单克隆抗体的研制

运用杂交瘤技术，我们成功地建立了两株能稳定分泌小鼠抗人乳头瘤病毒１６Ｅ６蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。经鉴定单克隆抗体均属ＩｇＧ１ｋ。试验结果表明，所得单克隆抗体仅与ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白反应，不与ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２融合蛋白以及Ｌ１－Ｌ２真核表达蛋白反应，也只与Ｃａｓｋｉ细胞反应，不与Ｈｅｌａ细胞反应。初步结果说明，该抗体是ＨＰＶ１６Ｅ１６蛋白特异性的ＭｃＡｂ。     

人乳头瘤病毒16型E7基因修饰小鼠骨髓树突状细胞诱导的细胞免疫应答

利用人乳头瘤病毒16型E7(HPV16-E7)基因修饰小鼠骨髓树突状细胞(DC)，探讨其修饰的DC是否能使机体产生特异性的免疫反应，为以DC为基础的主动性免疫基因治疗提供实验依据。     

中国地方株人乳头瘤病毒16型E7基因一级结构及其…

从湖北地区一宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ，采取加端聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，获得了人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因（ＨＰＶ１６Ｅ７）。将该基因克隆于载体ｐＵＣ１８后，进行了该基因一级结构顺序分析。完整的ＨＰＶ１６Ｅ７湖北株基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）全长２９４ｂｐ，与已发表的德国株（ＧＳ）大小一致，但其核苷酸顺序中有２处发生了变异，均为Ｃ→Ｔ变异。第４３位ＣＡＡ→ＴＡＡ使相应的谷氨酰胺密码子变为终止密码     

人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究

构建了含人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）－Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ（ｎｔ８３－８５５）片段和ＨＰＶ１６长控制区（ＬＣＲ）加Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ片段（ｎｔ７００７－７９０４／０－８７９）的逆转录病毒载体ｐＨ２１和ｐＨ１８质粒，利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将它们导入病毒包装细胞ｐＡ３１７中，经过筛选获得Ｇ４１８抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒Ｈ２１和Ｈ１８感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能在裸鼠体内形成肿瘤。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明，上述两基因片段都整合到细胞基因组中。本实验结果说明ＨＰＶ１６－Ｅ６Ｅ７基因片段是ＨＰＶ１６转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞的关键早期区，其自身ＬＣＲ区在该转化过程中没有显示出重要作用。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.     

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。     

HPV16型E7C亚基因与共激活分子B7-1协同诱导E7特异性CTL研究

目的利用去除Ｅ７的转化活性而保留其抗原性的Ｅ７Ｃ亚基因研制防治ＨＰＶ１６相关疾病的疫苗,并进一步探索利用Ｂ７－１研制更佳活化细胞免疫的加强疫苗。方法用ＰＣＲ方法扩增获得Ｅ７Ｃ后,插入真核表达质粒获得ｐＬＮＣＥ７Ｃ,体外真核细胞中证实其具有表达能力后,在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠后腿肌肉内直接进行裸ＤＮＡ接种免疫,或与ｐＬＮＣｍＢ７－１联合免疫接种,用５１Ｃｒ释放法体外分析经免疫鼠的细胞毒性Ｔ淋巴细胞活性。结果经免疫小鼠获得较好的Ｅ７特异性ＣＴＬ活性;若Ｅ７Ｃ与小鼠Ｂ７－１的表达质粒联合接种,则活性明显得到加强。结论Ｅ７Ｃ可以用于ＨＰＶ１６ＤＮＡ疫苗研制,Ｂ７－１具有推广应用价值     

子宫颈癌中人乳头瘤病毒16型E7基因检测及变异分析

用聚合酶链反庆法检测宫颈癌中人乳头瘤病毒１６型转化基因Ｅ７，检出阳性率为１０／２２，其中４例进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析发现该基因与标准对照株存在明显变异。核苷酸序列分析证实有两处发生碱基突变。研究提示，ＰＣＲ方法能快速检测宫颈癌中人乳头瘤 转化基因，可作为宫颈癌的辅助诊断方法，ＳＳＣＰ分析能发现病毒株间小变异的基因片段。     

Sequence variation of human papillomavirus type 16 E7 in preinvasive and invasive cervical neoplasias

Variation in the nucleotide sequence of the HPV 16 E7 gene in preinvasive cervical intra-epitherial neoplasia (CIN) and invasive cervical carcinoma specimens was analyzed. Direct DNA sequencing of PCR-amplified products with primers different from those used for PCR with 5-end labeling generated distinct sequence ladders with a low background, even in specimens containing relatively low copy numbers of HPV. Of 14 cervical neoplasias, 11 cases showed sequence diversity from prototype HPV16, and a total of 22 nucleotide exchanges were detected. Nine of these led to single amino acid exchanges: [Thr⁵] to [Lys⁵] in one case and [Asn²⁹] to [Ser²⁹] in eight cases. The [Ser²⁹] E7 was distributed uniformly among invasive carcinomas and precancerous legions, and was also found in a normal cervix. The [Lys⁵] E7 and [Ser²⁹] E7 had transforming potential similar to the prototype E7 assessed by cooperation with the activatedras gene in rat embryo fibroblasts.     

HPV16/18和HPV16E6/E7DNA在宫颈癌组织中的表达

目的检测HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA在宫颈癌组织中的表达,探讨其在宫颈癌发病中的作用.方法应用PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测46例宫颈癌组织中HPV16/18和HPV16E6/E7DNA.结果 46例宫颈癌中56.5%(26/46)扩增HPV16/18 DNA,其中宫颈鳞癌25例,宫颈腺癌1例.正常对照组20例HPV16/18DNA均为阴性,与宫颈癌组相比差异有显著性(P<0.01).HPV16/18 DNA阳性拷贝对数值为4.32±2.45.HPV16E6,E7DNA分别有53.8%(14/26)、46.2%(12/26)扩增.结论 HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA与宫颈癌的发生密切相关,是宫颈癌恶性转化的关键之一,预示着宫颈癌有较强的增殖能力和转移能力.     

HPV16 E6E7抗原表达模型的建立

目的 用基因重组技术构建pcDNA-E6E7真核表达载体.方法 经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCK法检测HPV16E6E7mRNA的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况.结果 酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入住点均正确,在转染的B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16E6E7mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下100%成瘤.结论 提示B16细胞转染E6E7后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异.     

Subcellular localization of the human papillomavirus 16 E7 oncoprotein in CaSki cells and its detection in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ

E7 is the major oncoprotein of high-risk human papillomaviruses (HPV) which causes cervical cancer. To date E7 oncoproteins have not been investigated in cervical adenocarcinoma. In this study we generated a rabbit monoclonal anti-HPV-16 E7 antibody, RabMab42-3, which recognizes a conformational epitope in the E7 carboxy-terminal zinc-finger resulting in a strong increase in the sensitivity for the detection of cell-associated HPV-16 E7 protein relative to conventional polyclonal anti-HPV-16 E7 antibodies. Using RabMab42-3, we show that the subcellular localization of endogenous HPV-16 E7 oncoprotein varies during the cell cycle in cervical cancer cells. Moreover, we demonstrate for the first time that the HPV-16 E7 oncoprotein is abundantly expressed in cervical adenocarcinoma in situ and adenocarcinoma, suggesting an important role of HPV-16 E7 for the development of these tumors. Our findings suggest that the HPV-16 E7 oncoprotein could be a useful marker for the detection of cervical adenocarcinoma and their precursors.