与雪旺细胞共培养诱导脂肪来源干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨非接触共培养条件下,大鼠SCs对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化效应,为神经组织工程寻找理想种子细胞提供参考。方法取新生1~2 d SD大鼠双侧坐骨神经,酶消化法分离培养SCs,并行S-100免疫荧光染色鉴定。取成年雄性SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪组织,差速贴壁法纯化获得ADSCs并传代,流式细胞仪检测第3代细胞表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。取原代SCs和第3代ADSCs按2∶1比例于Transwell共培养系统共培养(实验组),以单纯培养ADSCs作为对照组。倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,培养14 d流式细胞仪检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达,免疫荧光染色观察微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、神经元核蛋白(neuronal nuclei protein,Neu N)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)神经元特异性标志物表达情况,并计算阳性细胞率。结果成功分离培养ADSCs并能连续传代,流式细胞仪检测示其高表达CD29、CD90、CD73和CD105,低表达CD34和CD45。倒置相差显微镜下见,实验组共培养后原本呈梭形的ADSCs以胞核为中心收缩,胞体折光性增强,胞体伸出多个长而粗的突起;对照组ADSCs形态无显著变化。流式细胞仪及免疫荧光染色示,共培养后14 d实验组均表达神经元特异性标志物NSE、MAP2、Neu N、GFAP,且阳性细胞率显著高于对照组(P0.01)。结论 SCs与ADSCs非接触共培养,两者不仅能够共生,且SCs能显著促进ADSCs向神经元样细胞分化。     

残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体外软骨形成实验研究

目的探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源干细胞(adipose derived stemcells,ADSCs)向软骨分化并形成软骨样组织。方法取外耳再造术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织与皮下脂肪组织分离培养,分别收集第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs,以3∶7比例混合培养作为实验组(A组),单纯残耳软骨细胞和单纯ADSCs作为对照(分别为B组和C组)。取各组细胞1.0×106个离心培养获得细胞球后,体外培养28 d,大体观察各组细胞球取材时的外观变化,测量湿重;阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RT-PCR检测各组标本的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA表达;并行HE、甲苯胺蓝、番红O组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果体外培养28 d后,A、B组标本形成白色半透明圆盘状组织块,表面光滑,弹性可;C组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性。A、B组标本湿重及GAG含量显著高于C组(P<0.05);A、B组间差异无统计学意义(t=1.820 3,P=0.068 7;t=1.861 4,P=0.062 7)。RT-PCR检测示A、B组标本均可见Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA条带清晰表达,C组未见明显表达;A、B组Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA表达均显著高于C组(P<0.05),A、B组间差异无统计学意义(t=1.457 6,P=0.144 9;t=1.519 5,P=0.128 6)。组织学观察示:A组与B组细胞球标本形成了大量软骨陷窝样结构,细胞外基质均有不同程度染色;C组细胞球标本组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,细胞外基质染色阴性。A、B组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达,C组未见明显表达;A、B组灰度值显著低于C组(P<0.01),A、B组间差异无统计学意义(t=1.661 5,P=0.097 0)。结论残耳软骨细胞可在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织。     

共培养诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的初步研究

目的 探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性.方法 GFP标记的小鼠ES细胞初步分化为EB后,将EB消化为单个细胞,同猪关节软骨细胞按一定比例(1∶3)昆合后接种于PGA材料,体外培养1周后植入裸鼠皮下3周取材.对照组为EB细胞接种组及软骨细胞接种组.取材后行连续冰冻切片,切片分别做荧光拍照,HE染色及甲苯胺蓝染色.结果 组织学结果显示,EB细胞接种组形成畸胎瘤;软骨细胞对照组形成软骨组织;实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体.甲苯胺蓝染色结果和荧光照片对照结果显示,部分软骨组织GFP阳性,由小鼠ES细胞分化而来.结论 软骨共培养体系可以诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化,但得到的软骨组织不纯,混有畸胎瘤组织.     

生长分化因子5诱导兔脂肪干细胞成软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导脂肪干细胞(adipose-deftved stern cells,ADSCs)成软骨细胞分化的可能性及效果. 方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔6只,雌雄不限,体重2～3 kg.取兔皮下脂肪4～6 Ml,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验.波形蛋白免疫组织化学和CD44、CD49d、CDl06免疫荧光染色鉴定ADSCs.调整细胞密度为1×106个/Ml,分别用普通细胞培养液以及含0、10、100 ng/Ml GDF.5的软骨细胞诱导液诱导培养.倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖Mrna的表达;免疫组织化学、阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色和Western blot法检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖表达. 结果 ADSCs呈小圆形、梭形、多角形分布,表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106和波形蛋白呈阴性表达.100 ng/Ml GDF-5诱导的ADSCs呈圆形或类圆形,且细胞增殖旺盛.普通培养液和0、10、100 ng/Ml GDF.5成软骨细胞诱导培养后7 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna表达均呈浓度依赖性增加,除0、10 ng/Ml GDF-5两组间差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组差异均有统计学意义(P<0.05):100 ng/Ml GDF.5诱导培养14 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna以及蛋白表达达高峰,阿利新蓝、甲苯胺蓝染色以及Col Ⅱ免疫组织化学染色均呈阳性. 结论 经一定浓度的GDF-5诱导的ADSCs,Col Ⅱ和蛋白多糖表达明显增加,具有软骨细胞的部分生物学功能.     

不同培养条件下脂肪干细胞与软骨细胞共培养的研究

探讨病理状态下软骨细胞能否诱导脂肪干细胞(ADSC)向软骨细胞分化以及可能的最佳条件,以便为临床修复关节软骨损伤提供可能的新途径.[方法]分离共培养新西兰大白兔骨关节炎模型的ADSC和软骨细胞,根据不同血清浓度(10% FBS和2% FBS)和不同培养空间(纤维蛋白凝胶支架和无支架单层培养)分组,共培养14 d后,胰酶消化终止.倒置显微镜观察和透射电镜观察共培养后ADSC的形态变化.甲苯胺蓝染色法和免疫细胞化学检测共培养后ADSC的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达水平.RT-PCR检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平.[结果]共培养7 d后部分ADSC变圆,14d时ADSC形态高度分化与成熟软骨细胞相似,其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高,尤以10%FBS支架共培养组最为明显.[结论]与病理状态下软骨细胞共培养后,ADSC可以被诱导成软骨样细胞.高浓度血清三维培养可以增强这种诱导作用.     

残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究

目的验证残耳软骨细胞与脂肪来源的间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养,体内构建软骨的可行性。方法分离培养同一先天性小耳畸形患者来源的残耳细胞及脂肪干细胞。24只裸鼠随机分为4组:①实验组,接种残耳软骨细胞及脂肪干细胞,两种细胞以1∶1比例混合,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;②对照组1,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;③对照组2,接种单纯ADSCs,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;④对照组3,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为2.5×107 cells/mL。每组接种6只裸鼠,每只接种0.2 mL。体内培养10周后取材。通过对新生组织的大体观察、测量湿重、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色等方法对各组新生软骨进行比较。结果实验组、对照组1与对照组3产生不同组织量的软骨样组织,对照组2形成纤维样组织;实验组平均湿重及糖胺多糖含量达到对照组1的88%以上,对照组3平均湿重低于对照组1的40%;HE染色示实验组、对照组1与对照组3的标本均有软骨陷窝形成,对照组2未见软骨陷窝形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色示实验组、对照组1与对照组3均可见Ⅱ型胶原表达;对照组2未见Ⅱ型胶原表达。结论体内共培养条件下,残耳软骨微环境可有效促进脂肪干细胞向软骨方向分化,残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨具备可行性。     

脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究

目的 :研究脂肪干细胞的分离及向软骨方向定向诱导的方法。方法 :从成年兔颈后部或腹股沟处脂肪组织取材 ,酶消化法分离、培养脂肪干细胞 ;免疫荧光测定CD3 4 抗原的表达 ;流式细胞仪测定CD3 4 抗原百分比 ;分别用15 %牛血清、少血清 (5 % )及无血清诱导培养基定向软骨细胞方向诱导 ;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果 :从兔脂肪组织中能分离出生长旺盛的干细胞 ,CD3 4 抗原表达阳性 ,表达百分比与骨髓干细胞无明显差异 ;定向诱导后表现出软骨细胞的特性 ,诱导效果无血清诱导培养基效果最好。结论 :从兔脂肪组织中能分离出干细胞 ;生物学特性与骨髓干细胞相似 ;能向软骨细胞方向诱导 ;无血清诱导培养基效果最好。     

脂肪干细胞原代培养及其向表皮细胞诱导分化的研究

目的 探讨人脂肪干细胞(adipose-derivedstem cells,ADSCs)体外原代培养方法及诱导分化为表皮细胞的可能性.方法 利用酶消化法原代培养ADSCs,免疫细胞化学检测其相关表面抗原CD29、CD34、CD44、CD49d、CD80、CD106的表达;用表皮细胞诱导培养基对ADSCs进行体外诱导,观察细胞的生长情况及形态变化;对诱导前后两种细胞行细胞增殖活性及细胞角蛋白表达检测.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,且能稳定传代;免疫组织化学染色证实有特定的干细胞表面标记物表达;对ADSCs成功进行了体外诱导培养,其细胞形态及蛋白表达均有向表皮细胞分化的倾向,并且仍具较高增殖活性.结论 利用酶消化法可在体外成功培养ADSCs,并能持续传代;ADSCs表达特定的干细胞表面抗原;ADSCs可成功进行体外诱导,有向上皮细胞分化的倾向.     

不同状态软骨细胞在共培养系统下对BMSCs向软骨细胞诱导分化作用的研究

[目的]观察不同代次正常软骨细胞和关节炎软骨细胞对琼脂糖-BMSCs向软骨细胞分化的促进作用.[方法]分离新西兰兔BMSCs,正常软骨细胞.制作兔关节炎模型,提取兔关节炎软骨细胞.将BMSCs和低熔点琼脂糖复合成凝胶块,放在自制的六孔板网格架上,构建兔软骨细胞-BMCSs共培养系统.在3、7、14 d取各组琼脂精BMSCs凝胶块进行实时定量PCR、GAG含量检测.[结果]兔关节炎模型制作成功,关节面色泽较灰暗,关节软骨粗糙.Normal PO-BMSCs组的Ⅱ型胶原基因表达明显增强,Normal P3-BMSCs组Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达均未见明显增强,OA PO-BMSCs组蛋白聚糖基因表达明显增强,OA P3-BMSCs组Ⅰ型胶原基因表达水平在3个时间点均低于对照组.Normal PO-BMSCs组的GAG含量为5.7±0.49μg/mg(湿重),较对照组有明显上升.OA PO BMSCs组GAG含量与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),其余三组与对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05).[结论]兔正常PO软骨细胞与兔关节炎PO软骨细胞所分泌的形态发生素能够有效促进BMSCs向软骨细胞分化,而兔正常P3软骨细胞的促分化作用微弱,兔关节炎P3软骨细胞不能促进BMSCs向软骨细胞分化.     

兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞的诱导分化作用

目的探讨兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化作用。方法取4月龄健康新西兰大白兔(体重2.0~2.5 kg)体外分离、培养ADSCs并传至第3代;用b FGF预诱导后,加入正常坐骨神经匀浆上清液(B组)及损伤3、7、14 d的坐骨神经匀浆上清液(分别为C、D、E组)对其进行诱导,空白对照组(A组)仅加入D-Hank液。观察细胞形态变化,并采用实时荧光定量PCR检测各组细胞神经组织蛋白(S-100)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及巢蛋白(Nestin)基因表达,免疫细胞化学染色检测S-100蛋白表达。结果 C、D、E组细胞经诱导后逐渐出现雪旺细胞或神经细胞样形态改变,以D组变化最为明显;A、B组细胞形态未见明显改变,仍以梭形为主。S-100免疫细胞化学染色示,C、D、E组染色均为阳性,以D组阳性细胞最多;A、B组细胞无阳性表达。实时荧光定量PCR检测示,S-100基因表达量随损伤时间延长呈上升趋势,C、D组达高峰,之后缓慢下降;C、D组表达量显著高于A、B、E组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。NSE基因表达量呈相同趋势,D组达高峰,之后缓慢下降;D、E组表达量显著高于A、B、C组(P0.05),D、E组间差异亦有统计学意义(P0.05)。Nestin基因表达量各组间差异无统计学意义(P0.05)。结论兔损伤坐骨神经匀浆上清液在体外能够有效诱导ADSCs分化为雪旺细胞和神经细胞,伤后早期(3~7 d)可作为细胞移植的最佳时间。     

自体PRP促进人脂肪来源干细胞成骨分化的体外实验研究

目的 探讨自体PRP对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 取自愿捐献吸脂术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs,倒置显微镜下观察细胞生长情况.将第3代ADSCs分别行成脂、成软骨定向诱导培养鉴定,并行CD29及CD44免疫荧光染色观察.取第3代ADSCs分别采用含10 mL/L PRP的成骨诱导培养基(PRP组)和不含PRP的成骨诱导培养基(对照组)进行培养,倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5 d采用MTT法检测细胞增殖活性;7、14、21、28 d行ALP活性检测,另取培养7、14 d的PRP组细胞行ALP染色观察;14 d时行PRP组茜素红染色检测钙结节形成情况.结果 倒置显微镜下第3代ADSCs多为梭形,倍增时间约35 h.成脂及成软骨诱导鉴定均为阳性,免疫荧光染色CD29和CD44呈阳性.MTT法示PRP组1、2、3、4、5 d的吸光度值分别为0.137±0.015、0.219±0.023、0.367±0.031、0.586±0.039、0.948±0.046,对照组分别为0.081±0.009、0.115±0.012、0.162±0.017、0.242±0.025、0.356±0.032,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导7 d后,PRP组ALP染色阳性,细胞胞浆呈灰黑色,可见黑色沉淀:14 d后阳性细胞增多.ALP活性检测示PRP组7、14、21、28 d细胞活性值分别为23.96±2.05、41.26±3.38、38.12±3.03、35.89±2.24,对照组分别为17.83±1.62、26.64±2.37、23.85±1.99、20.78±1.81,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导14 d后,茜索红染色示PRP组钙结节形成.结论 体外培养时,自体PRP可促进人ADSCs的增殖并诱导成骨分化,为骨组织工程提供一种新的种子细胞来源.     

胰岛素干预后脂肪来源干细胞分泌功能对HaCaT细胞生物学影响

目的 分离培养脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨胰岛素刺激前后其分泌因子的变化及对人角质形成细胞株HaCaT细胞生物学影响.方法 从腹部外科手术患者自愿捐献皮下脂肪组织中分离、培养ADSCs,取第3代ADSCs调整密度为5×104个/mL,采用1×10-7mol/L胰岛素刺激作为A组,以未加胰岛素刺激作为B组,培养3 d后收集两组ADSCs培养上清液(conditioned medium of ADSCs,ADSC-CM),ELISA法测定其VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)含量.取人角质形成细胞株HaCaT细胞培养,将第4代细胞根据培养液不同分为4组.A1组:含A组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL:B1组:含B组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL;C1组:1 mL含终浓度为1×10-7mol/L胰岛素的2%FBS;D1组:仅含2%FBS 1 mL.培养3 d采用MTT法测定HaCaT细胞增殖情况:培养12 h Annexin V-FITC双染测定细胞凋亡情况;培养0、12、24、36、48 h采用体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果 A组VEGF、HGF含量分别为(643.28±63.57)、(929.95±67.52)pg/mL,B组分别为(286.52±46.68)、(576.61±84.29)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞增殖测定A1、B1组吸光度值分别为0.881±0.039、0.804±0.041,与C1组(0.663±0.027)及D1组(0.652±0.042)比较,差异有统计学意义(P＜0.01);A1组高于B1组(P＜0.05).A1、B1组凋亡率分别为5.23%±1.98%、8.82%±2.59%,均低于C1组(31.70%±8.85%)和D1组(29.60%±8.41%),差异有统计学意义(P＜0.05),但B1组凋亡率高于A1组(P＜0.05).A1、B1、C1和D1组36 h迁移距离分别为(0.184 6±0.019 2)、(0.159 8±0.029 4)、(0.059 2±0.017 6)及(0.058 2±0.012 3)mm,48 h分别为(0.231 8±0.174 0)、(0.205 1±0.012 1)、(0.079 2±0.008 1)及(0.078 4±0.0117)mm,两时间点A1组和B1组距离明显大于C1组和D1组(P＜0.01),A1组大于B1组(P＜0.05);其他时间点迁移距离差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胰岛素干预后ADSCs能更有效促进HaCaT细胞增殖、迁移和抑制凋亡.     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

自组装多肽纳米凝胶支架三维培养前软骨干细胞的实验研究

目的构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响。方法取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选纯化原代细胞,并进行鉴定。取KLD-12、KLD-12-PRG多肽冻干粉,以体积比1∶1复合构建RGDmx。将纯化后的第3代PSCs接种至KLD-12(对照组)和RGDmx(实验组)培养,1、3、7、14 d用细胞计数(cell counting kit,CCK)-8法检测支架细胞增殖-毒性;制备不同混合比(0、20%、40%、60%、80%、100%)RGDmx,观察其对PSCs增殖的影响;采用无血清软骨形成培养液(complete chondrogenic medium,CCM)诱导两组支架内PSCs向软骨细胞方向分化,培养14 d时行甲苯胺蓝染色法鉴定,并用RT-PCR法检测两组软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达情况。结果成功分离纯化获得成纤维细胞生长因子受体3表达阳性细胞,免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定为PSCs。CCK-8检测结果显示,复合培养后实验组细胞吸光度(A)值随培养时间延长逐步提高,7 d达峰值;其中7、14 d时细胞A值高于对照组(P<0.05);复合培养7 d时,混合比为40%组细胞A值较其他混合比组高,差异有统计学意义(P<0.05)。CCM诱导培养14 d时,两组支架内细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性;RT-PCR检测示实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx具有良好的细胞相容性,可有效促进PSCs增殖及向软骨细胞方向分化,是组织工程较理想的细胞载体系统。     

骨髓间充质干细胞在肌组织局部成肌分化的实验研究

目的 探讨骨髓问充质干细胞(marrow mesenchmal stem cells，MSCs)移植至肌肉组织后的原位成肌分化情况。方法 以BalB／C雌性小鼠36只，建立放射损伤合并创伤(切割伤 冻伤)的严重肌损伤模型，再将分离扩增的雄性小鼠的单纯MSCs及经10μmol／L 5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza—CR)诱导24h的MSCs以局部注射移植法，植入雌性小鼠正常肌肉组织和创伤后的肌肉组织，采用荧光标记的原位杂交法、免疫组织化学法在移植后1、3、6、9、12及15d检测植入的MSCs在肌肉组织原位的数量变化及成肌分化情况。结果 植入的MSCs数量随着时相延长而减少；单纯MSCs植入正常肌肉组织15d，5-Aza-CR诱导后的MSCs植入正常肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性；5-Aza-CR诱导的MSCs植入损伤肌肉组织3d，单纯MSCs植入损伤肌肉组织6d，可见MSCs分化为肌细胞，表达desmin阳性。结论 MSCs局部移植至肌肉组织局部可实现成肌分化，但经5-Aza-CR诱导后的MSCs植入损伤肌肉组织的MSCs其成肌分化时相明显早于单纯MSCs植入正常肌组织的MSCs。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的体外研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞( marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞定向分化中神经蛋白分子的表达情况。　方法　取第5～7代体外培养Wistar大鼠MSCs,以0 .5μmol/ L全反式视黄酸( all- trans retinoidacid,ATRA)预诱导2 4 h后,换用改良神经细胞培养基( modified neuronal medium,MNM)继续培养。在ATRA作用2 4 h及MNM作用2、6、9、18及36 h,免疫组织化学检测巢蛋白( Nestin)、神经元特异性核心抗原( neuron- specificnuclear protein,Neu N)、微管相关蛋白2 ( microtubule- associated protein 2 ,MAP- 2 )和胶质纤维酸性蛋白的表达情况。　结果　ATRA和MNM作用后,MSCs呈典型神经元样,伸出较多的突起和分支,形成网络。Nestin最先表达,ATRA作用2 4 h出现,Neu N其次,MNM作用2 h检测到,MAP- 2最晚,MNM作用9h检测到。Nestin在MNM作用18h后表达最强,其阳性率为92 .3%±3.4 % ;36 h后表达明显减弱,阳性率仅为12 .3%±3.4 % ,而其它标志蛋白则持续表达。　结论　ATRA和MNM能促进MSCs向神经前体细胞和神经元转化,神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致,为研究神经细胞发育提供了一个较好的体外模型     

去细胞异种神经复合同种异体脂肪干细胞修复猕猴周围神经缺损的免疫反应研究

目的观察去细胞异种神经复合同种异体脂肪干细胞修复猕猴周围神经缺损后的全身及局部免疫排斥反应,评价该修复材料的安全性。方法健康成年雄性长白猪1只,体重48 kg,取胫神经制备去细胞异种神经;健康成年雄性猕猴1只,体重4.5 kg,分离培养脂肪干细胞;健康成年雌性猕猴10只,体重3～5 kg,制备25 mm长桡神经缺损动物模型,随机分为复合细胞组和无细胞组(n=5),前者采用去细胞异种神经复合第3代脂肪干细胞移植修复,后者采用去细胞异种神经移植修复。于术前及术后14、60、90 d抽取外周静脉血行淋巴细胞分析;术后5个月取材观察移植物组织免疫反应和神经再生情况,并与自体神经移植组作比较。结果复合细胞组与无细胞组术前及术后各时间点外周静脉血淋巴细胞数量、T淋巴细胞百分率及其数量、CD8+T淋巴细胞百分率、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);术后14 d,复合细胞组CD4+T淋巴细胞百分率低于其余时间点,差异有统计学意义(P<0.05);同一时间点两组间比较,除术后14 d复合细胞组CD4+T淋巴细胞百分率低于无细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各时间点各指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后5个月,去细胞异种神经与周围组织有轻度粘连,神经外膜较自体神经厚,未见组织坏死、纤维瘢痕形成,移植物内见再生神经纤维,复合细胞组、无细胞组均有稀疏的CD3+、CD4+、CD8+、CD68+、CD163+T淋巴细胞散在分布,细胞浸润情况与自体神经移植组类似。结论去细胞异种神经移植修复猕猴周围神经缺损后未产生全身及局部免疫排斥反应;复合同种异体脂肪干细胞移植后也未发现免疫排斥反应,且术后早期可能抑制CD4+T淋巴细胞增殖。     

骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的初步实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)分化为创面皮肤附属器细胞的可能性,及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取Wistar大鼠股骨骨髓细胞,密度梯度离心分离、纯化MSCs,体外培养扩增后,用BrdU标记细胞。另于同种雄性Wistar大鼠背部正中,制备1cm×1cm全厚皮肤缺损创面模型,将BrdU标记的1×106/mlMSCs从阴茎静脉输注,术后第3天与第7天切取创面组织,行BrdU免疫组织化学单染色,以及BrdU和广谱角蛋白免疫组织化学双染色。结果BrdU阳性细胞出现在创面皮下组织、皮脂腺、毛囊和骨髓腔中。免疫组织化学双染色结果显示,皮脂腺和毛囊有BrdU阳性细胞,同时表达广谱角蛋白。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在实验性全身皮肤缺损创面微环境下,MSCs可分化为皮肤附属器细胞。