siRNA沉默RhoA治疗心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大的实验研究

目的观察应用小RNA干扰（siRNA）技术沉默RhoA对心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大的治疗效果。方法构建沉默RhoA mRNA表达的siRNA质粒,结扎冠状动脉左前降支,建立心肌梗死模型。分梗死组（MI组）、空载质粒组和RhoA siRNA治疗组;术后21d,测定大鼠左室重量指数,心肌细胞横断面积,RT-PCR检测RhoA mRNA表达,Western-Blot检测RhoA蛋白表达水平,并行病理切片HE染色。结果术后21d,RhoAsiRNA治疗组大鼠心肌左室重量指数,心肌细胞表面积,RhoA mRNA表达水平以及RhoA蛋白表达水平较梗死组（MI组）、空载质粒组显著降低,且有统计学差异（P〈0.05）,与病理切片HE染色一致。结论靶向RhoA的siRNA技术通过对RhoA的有效沉默可明显减轻心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大发挥良好的治疗效果。     

辛伐他汀抑制心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大与RhoA激酶关系

目的:观察辛伐他汀对心肌梗死后大鼠心肌细胞肥大的抑制作用,探讨小G蛋白RhoA激酶(RhoA kinase,ROCK)在辛伐他汀调控心肌细胞肥大中的信号转导作用.方法:雄性Wistar大鼠,分为4组,每组8只.结扎冠状动脉左前降支,建立心肌梗死模型.假手术组(SHAM组)和梗死组(MI组)予生理盐水1 ml/d灌胃.辛伐他汀组(SIM组)予辛伐他汀40mg/(kg·d)灌胃.Fasudil组(F组)予特异性ROCK抑制剂Fasudil 7.5 ms/ks,bid腹腔注射.术后28 d,测定大鼠左室重量指数,心肌细胞横断面积,RT-PCR检测ROCK mRNA表达,免疫组化和Western-Blot检测ROCK活性标志物-磷酸化ERM(Phospho-ERM)蛋白表达水平.结果:术后28 d,MI组大鼠心肌左室重量指数,心肌细胞表面积,ROCK mRNA表达水平以及Phospho-ERM蛋白表达水平较SHAM组明显增高,SIM组和F组前述各项检测指标均较MI组显著降低.结论:辛伐他汀能抑制心梗后心肌细胞肥大,其作用机制可能与他汀抑制ROCK途径有关.     

肾上腺素诱导培养新生大鼠心肌细胞肥大的实验研究

目的 :探讨肾上腺素诱导心肌细胞肥大的作用。方法 :在培养新生大鼠心肌细胞上 ,通过测量心肌细胞表面积和[3H] -Leu的掺入量来判断心肌细胞肥大。结果 :肾上腺素能明显增加心肌细胞表面积和[3H] -Leu的掺入量 ,并呈量效关系。结论 :肾上腺素有诱导心肌肥大作用     

Urocortin致大鼠心肌细胞肥大由PKA信号通路介导

目的 通过观察PKA拮抗剂H-89和CRF受体拮抗剂Astressin抑制UCN诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用,研究UCN诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号转导机制.方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型,应用UCN 0.1μmol·L-1诱导心肌肥大,观察H-89 0.1 μmol·L-1和Astressin 1 μmol·L-1的作用,探讨UCN 0.1μmol·L-1对心肌肥厚的作用机制.用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白的合成;用Western蛋白印迹法测定ANP表达.结果 UCN 0.1 μmol·L-1使心肌细胞体积、蛋白合成和ANP表达明显增加,H-89 0.1μmol·L-1和Astressin 1μmol·L-1抑制UCN诱导的心肌肥大.结论 Urocortin可能通过CRF-R2并通过PKA信号通路诱导乳大鼠心肌细胞肥大.     

熊果酸抑制AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大实验研究

目的 探讨熊果酸（ursolic acid,UA）对血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）诱导大鼠心肌细胞肥大的抑制作用及其可能机制。方法 按常规方法分离并培养新生大鼠心肌细胞。CCK-8法确定UA（2、4、8、16μmol/L）对心肌细胞的最佳作用浓度,利用AngⅡ诱导建立新生大鼠心肌细胞肥大模型。实验分对照组（control组）、AngⅡ组、UA干预组、LY294002（PI₃K/Akt通路抑制剂）干预组共4组。UA和LY294002均预处理心肌细胞30min。以心肌细胞表面积、β-肌球蛋白重链（β-MHC）mRNA和脑钠肽（BNP）mRNA表达作为心肌细胞肥大标志,同时使用蛋白免疫印迹法检测T-Akt（total Akt）和p-Akt（phospho-Akt）蛋白表达。结果 显微镜下观察各组心肌细胞生长良好。与control组相比,AngⅡ组和UA干预组大鼠心肌细胞表面积增加（P<0.05）,LY294002干预组心肌细胞表面积差异无统计学意义（P>0.05）;与AngⅡ组相比,UA干预组和LY294002干预组大鼠心肌细胞表面积减小（P<0.05）。与control组相比,AngⅡ组的p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达显著增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比,UA干预组和LY294002干预组的p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达均降低（P<0.05）;UA干预组和LY294002干预组之间p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达均差异无统计学意义（P>0.05）;4个实验组间T-Akt蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论 （1）AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大模型中,心肌细胞表面积增加,BNP mRNA和β-MHC mRNA表达升高,同时伴有p-Akt蛋白表达增加,提示PI₃K/Akt通路在AngⅡ致心肌细胞肥大中起重要作用。（2）UA能减轻AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大,使心肌细胞表面积减小,p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达减少,这与LY294002作用一致,提示UA可能是通过抑制PI₃K/Akt通路而发挥抗心肌肥大作用。     

神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大的效应观察

目的 :观察神经肽Y(NPY)诱导大鼠心肌细胞肥大效应。方法 :用不同浓度NPY(10nmol/L、10 0nmol/L)刺激心肌细胞 ,应用3 H Leu掺入量法测定心肌细胞蛋白质合成速率、RT PCR法测心肌细胞c junmRNA表达。结果 :1.心肌细胞3 H Leu掺入量测定 :较大剂量NPY刺激心肌细胞蛋白合成速率显著增加。与对照组相比 ,NPY10nmol/L组3 H Leu掺入量有所增高 ,但差异无显著性 ,而NPY10 0nmol/L组心肌细胞 3H Leu掺入量较对照组明显增高 (P <0 .0 5 )。 2 .心肌细胞内c junmRNA表达 :NPY组心肌细胞c junmRNA的RT PCR产物量明显高于对照组(P <0 .0 0 1)。结论 :NPY刺激心肌细胞蛋白质合成增加、心肌细胞原癌基因 (肥大早期反应基因 )c junmRNA表达增加 ,提示NPY可通过其生长因子样效应 ,诱导心肌细胞肥大。     

一氧化氮抑制牵张刺激心肌细胞肥大反应的实验研究

目的　探讨一氧化氮 (NO)对牵张刺激心肌细胞肥大的抑制作用。方法　用分光光度法、原位杂交及图像分析法测定蛋白、DNA含量及 β MHCmRNA表达。 结果　 2 0 %牵张刺激可诱导培养心肌细胞内游离Ca2 + 含量迅速升高 ,12～ 2 4h即见蛋白质合成及 β MHCmRNA显著增加。大于 3× 10 - 4mol L的硝普钠 (NO供体 )可显著抑制牵张刺激诱导的心肌细胞蛋白质合成及 β MHCmRNA表达。NO可同时使牵张刺激引起的细胞内游离Ca2 + 浓度升高受到抑制。结论　一氧化氮可显著抑制牵张刺激诱导的心肌细胞肥大反应 ,这种抑制可能是通过降低细胞内游离Ca2 + 浓度而发挥作用的。     

实验小猪急性心肌梗死后心肌细胞凋亡机制的动态研究

目的 动态观察实验小猪急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）后心肌梗死部位的缺血区心肌细胞凋亡及Caspase-3蛋白的表达,探讨 AMI后心肌细胞的凋亡机制。方法 将8只中华小猪全麻后行冠脉造影及钝缘支(Obtuse Marginal Branch, OM)明胶海绵封堵术,其中1只小猪作为对照组仅行冠脉造影,余7只小猪AMI模型建立成功后,分别于心梗后第1、3、5、7、10、14和28d处死小猪,并取心肌梗死部位的缺血区行TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 法检测心肌细胞凋亡指数（Apoptotic Index, AI）及免疫荧光检测心肌组织中Caspase 3蛋白表达情况,并按caspase 3阳性表达密度进行统计。结果 TUNEL法检测心肌AI结果,对照组心肌AI为（2.1±1.0）%,各实验组心肌AI分别是（67.8±4.3）%、（436±5.7）%、（39.5±4.2）%、（38.3±7.4）%、（26.7±3.5）%、（19.8±6.2）%和（18.6±5.4）%;对照组caspase-3表达密度为3.6%,各实验组依次是78.8%、58.2%、56.3%、54.5%、49.6%、34.6%和32.1%。通过成功建立小猪AMI模型并观察心肌AI在心梗后第1d达最高峰,依次逐渐下降,在第5~7d下降基本上呈平稳状态,在第14~28d处于低水平状态;免疫荧光caspase-3阳性表达在心梗后第1d达顶峰,后逐渐下降,直至第14~28d呈低水平表达。结论 在AMI后心肌梗死周边及缺血区域发现有大量凋亡因子caspase-3蛋白存在,在心肌受到急性缺血缺氧刺激时,加速诱导心肌细胞凋亡的启动,出现细胞凋亡现象,这与心肌重构、心肌间质纤维化及心肌收缩功能等心脏结构及功能改变密切相关。     

心肌细胞肥大的分子机制

心肌肥大是许多心脏病的共同病理表现之一，同时也是心功能不全和心律失常的重要病理基础,本文综述了近年来心肌肥大发生的分子机制，包括心肌细胞肥大的刺激因素，心肌细胞肥大过程中胞内信号的传导途径，细胞外基质、细胞骨架以及心脏转录因子在心肌肥厚发生中的作用等。     

肥大心肌细胞能量代谢途径变化及药物干预效应研究

目的 探讨肥大心肌细胞能量代谢途径变化及药物干预的作用。方法 应用血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ,0．1μmol／L）加去甲肾上腺素（norepinephrine,NE 1μmol／L）诱导培养大鼠心肌细胞肥大,以同位素液闪计数法测定丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase,PDH）、肉碱脂酰转移酶-1（carnitine palmitoyhransferase 1,CPT-1）活性,以及葡萄糖有氧氧化率、葡萄糖酵解率和脂肪酸有氧氧化率。结果 （1）与正常心肌细胞比较,肥大心肌细胞总的PDH活性没有明显改变,但活化型PDH活性和葡萄糖氧化代谢率（glucose oxidation rate,GOR）显著增强,CPT-1活性和脂肪酸有氧氧化代谢率（fatty acid oxidationrate,FOR）显著降低;（2）与对照肥大心肌细胞比较,二氯乙酸（dichloroacetate,DCA 1000～10000mmol／L）和曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ 1～5mmol／L）呈剂量依赖性的升高PDH活性和GOR,抑制CPT-1活性、FOR和葡萄糖酵解率（glucolysis rate,GLR）;（3）与对照肥大心肌细胞比较,抗霉素A（antimycin A,0．1～10mmol／L）呈剂量依赖性的抑制PDH活性和GOR和GLR,增强CPT-1活性和FOR;（4）二氯乙酸（1000mmol／L）加曲美他嗪（1mmol／L）可更有效刺激PDH活性和GOR,抑制CPT-1活性、FOR和GLR。结论 肥大心肌细胞能量代谢向糖代谢转化,DCA和TMZ均可进一步增强糖有氧氧化代谢抑制脂肪酸代谢。     

MN9202对L-甲状腺素所致大鼠心肌肥厚的影响

目的 探讨三氢吡在钙拮抗剂,２,６－二甲基－４－（３－硝基苯基）－１,４－二氢３,５吡二羧３－甲酯５－正戊酯（ＭＮ９２０２）在Ｌ－甲朱素（Ｌ－ｔｈｙｒｏｘｌｉｎｅ,Ｌ－Ｔｈｙ）引起大鼠心肌肥厚时对心脏指数,心肌超微结构及心肌组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胶甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量的影响。方法 连续１２ｄ ｉｐ Ｌ－Ｔｈｙ０．５ｍｇ．ｋｇ＾－１．ｄ＾－１复制大鼠心肌     

鞘内注射针对Toll样受体4基因的siRNA缓解坐骨神经结扎大鼠的神经病理性疼痛

目的观察坐骨神经结扎(CCI)大鼠鞘内注射针对Toll样受体4基因(TLR4)的siRNA(TLR4-siRNA)的镇痛作用及对脊髓TLR4、IL-1β、TNF-α表达的影响。方法大鼠随机分为4组(每组10只):假手术组、CCI组(鞘内注射生理盐水)、错配siRNA组(鞘内注射错配siRNA)及siRNA-TLR4组(鞘内注射TLR4-siRNA)。后3组大鼠均行右侧坐骨神经结扎术,并行L5～L6鞘内置管;假手术组仅暴露坐骨神经而不结扎。TLR4-siRNA组大鼠从CCI术前1 d开始鞘内注射脂质体包裹的有效TLR4-siRNA(10μg/30μl),连续7 d;CCI组、错配siRNA组分别注射等量生理盐水和错配siRNA。采用热辐射及von Frey测痛丝分别测定各组大鼠的热痛阈及机械性痛阈;采用实时定量RT-PCR法观察各组大鼠脊髓组织TLR4 mRNA的表达;采用ELISA法测各组大鼠脊髓组织炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。结果与假手术组相比,坐骨神经结扎后,大鼠热痛阈及机械性痛阈降低,脊髓TLR4 mRNA表达量增加,脊髓组织IL-1β、TNF-α的含量也增加(P<0.05)。与生理盐水组及错配siRNA组相比,鞘内注射TLR4-siRNA可抑制坐骨神经结扎引起的热痛觉过敏及机械性异常性疼痛(结扎后1、3、7 d,P<0.05),降低脊髓TLR4 mRNA表达(P<0.05),降低脊髓IL-1β、TNF-α含量(P<0.05)。结论鞘内注射TLR4-siRNA可通过干扰大鼠脊髓TLR4基因表达抑制其信号通路下游炎症因子的水平,进而缓解坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛。     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建和表达及对HeLa细胞的影响

目的应用RNA干扰技术(RNAi)针对凋亡抑制因子survivin存活素的siRNA抑制Hela细胞株内源survivin基因的表达以及可促进Hela细胞凋亡。方法构建重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2并分别转染Hela细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞株的凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA阴性非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少;通过PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞的凋亡分别达(36.02±2.12)%(P<0.01)和(35.29±2.02)%(P<0.01)。结论重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制Hela细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进Hela细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。     

Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响

目的构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒p Ad Track CMV中获得p Ad Track-siRaf-1质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与p Ad Easy-1骨架质粒进行同源重组获得p Ad-siRaf-1质粒,后转染HEK293细胞,包装获得p Ad-siRaf-1腺病毒颗粒,继而感染原代培养的心肌细胞,通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液体闪烁计数仪测定3H-亮氨酸([3H]-leu)掺入率,用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了p Ad-siRaf-1重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达,抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。     

靶向大鼠糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白siRNA腺病毒载体的构建及对L6细胞的感染

目的：构建靶向大鼠糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（ GILZ）的siRNA腺病毒载体,并感染体外培养的大鼠L6成肌细胞,为进一步研究GILZ对脓毒症骨骼肌代谢的调控作用提供实验基础。方法（1）设计3条靶向大鼠GILZ mRNA的特异性siRNA序列和1条阴性对照序列,合成各序列的Oligo DNA,退火形成双链后,插入AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的载体GV119,构建腺病毒穿梭质粒,经测序证实构建成功后,与腺病毒骨架质粒pBHG lox△E1,3 Cre共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒,分别命名为Ad－siRNA－1－GILZ、Ad－siRNA－2－GILZ和Ad－siRNA－3－GILZ,扩增纯化后测定病毒滴度。（2）0.1、1.0、10.0μL重组腺病毒在不同类型培养液（完全培养液、Enhanced Infection Solution、含5μg／mL Polybrene的完全培养液、含5μg／mL Polybrene的Enhanced Infection Solution）中感染L6细胞,显微镜下观察L6细胞形态改变和绿色荧光蛋白表达情况,确定最佳感染条件。（3）分别以阴性对照病毒（阴性对照组）、Ad－siRNA－1－GILZ（Ⅰ组）、Ad－siRNA－2－GILZ（Ⅱ组）和Ad－siR-NA－3－GILZ（Ⅲ组）感染L6细胞,Real time－PCR检测各组GILZ mRNA的表达量。结果（1）经测序分析和PCR验证,成功构建重组腺病毒载体,经测定滴度为2.0×1010 PFU／mL。（2）10μL重组腺病毒在Enhanced Infec-tion Solution的感染效果最佳,感染效率达80％。（3）重组腺病毒感染L6细胞后,细胞无明显坏死,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达。（4） Real time－PCR结果显示,Ⅱ、Ⅲ组GILZ mRNA表达量与阴性对照组比较差异无统计学意义（ P＞0.05）,Ⅰ组GILZ mRNA表达量较阴性对照组明显降低（ P＜0.01）,其沉默效率为59.8％。结论成功构建靶向大鼠GILZ的siRNA腺病毒载体,并可在体外细胞水平明显下调GILZ的表达,为后续研究GILZ对脓毒症骨骼肌蛋白代谢的调控作用提供实验基础。     

神经肽Y拮抗去甲肾上腺素在杏仁核的心血管效应

为了解杏仁内侧核内神经肽Ｙ（ＮＰＹ）和去甲肾上腺素（ＮＡ）的相互关系，向杏仁内侧核（ＭＡＮ）内微量注射ＮＰＹ，或微电泳ＮＰＹ，观察神经元单位放电和测量动脉血压，并在血压改变的条件下测量血浆中ＮＡ含量。结果发现，ＮＰＹ可以对抗ＮＡ的升压作用，微电泳ＮＰＹ到ＭＡＮ也得到相同结论。向ＭＡＮ注入ＮＰＹ后血浆中ＮＡ的含量明显减少，这可能是ＮＰＹ拮抗ＮＡ作用的原因之一。     

银杏叶提取物对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚的影响

目的:研究银杏叶提取物(Extract of ginkgo biloba,EGb)对异丙肾上腺素(Isoprenaline,Iso)诱导的大鼠心肌肥厚的影响.方法:大鼠30只分为正常对照组、ISO模型组和EGb治疗组.测定全心重量指数(Heartweight/Body weight,HW/BW)、左心室重量指数(Left ventricle weight index,LVI);检测左心室心肌组织中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷光苷肽过氧化酶(Glutathione-SH pexoxidase,GSH-Px)、一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthetase,NOS)活性.结果:ISO模型组的HW/BW、LVI、左心室MDA含量和诱生型NOS(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性显著高于正常对照组(P<0.05),SOD、GSH-Px及结构型NOS(Constitutive nitric oxide synthase,cNOS)活性比正常对照组低(P<0.05);EGb治疗组左心室MDA含量、iNOS活性和心脏重量指数比ISO模型组低(P<0.05),SOD、GSH-Px和cNOS活性明显高于ISO模型组(P<0.05).结论:EGb对ISO诱导的心肌肥厚的发生有预防作用.     

靶向人端粒酶小干扰RNA对人喉癌Hep-2细胞系形态学影响

目的探讨靶向人端粒酶基因siRNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞形态学的影响。方法根据人端粒酶基因设计和合成人端粒酶siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,观察形态学结构。结果转染siRNA48h后细胞皱缩、变圆并开始脱落。HE染色显示细胞呈明显的良性转化。透射电镜下可见细胞凋亡、胀亡的形态改变。结论靶向人端粒酶基因的siRNA能促使Hep-2细胞形态呈良性转化,并能促进肿瘤细胞凋亡。