大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法 从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITCBSI结合试验）。结果 倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论 改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITC-BSI结合试验）。结果倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的探索一种简便可行的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells,BMECs)的培养方法,为研究BMECs在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持.方法分离出生后1～4 d内的Wistar大鼠乳鼠大脑皮质,用植块法培养BMECs;用倒置显微镜观察BMECs的形态以及从皮质块细胞迁出的过程;通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光细胞化学法对培养细胞进行鉴定.结果大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形、三角形、四边形为主,呈典型的"铺路石"样征象,第3代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达95%以上.结论植块法具有经济、简便、要求条件不高,可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞的优点.     

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法的改良。方法 采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论 本方法可获得纯度高,结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

肺微血管内皮细胞培养的改进方法

将大鼠肺边缘 2mm组织剪下并剪成 1mm× 1mm× 1mm大小的组织块 ,使其紧紧贴附于玻片上 ,而后用含有 2 0 %新生牛血清、RPMI 16 40、H EPES、2 巯基乙醇、丙酮酸钠、谷氨酰胺、卡那霉素、碳酸氢钠培养液培养。结果 2 4h肺微血管内皮细胞游出 ,72h左右游出的内皮细胞可融合成片状并紧紧贴附于玻片上 ,经Ⅷ因子相关抗体间接免疫荧光染色呈阳性。该方法具有快速简单、经济、重复性好等优点。     

人胎盘微血管内皮细胞体外原代培养及鉴定方法

目的探索人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,并对其进行鉴定,为构建体外人胎盘屏障极性模型奠定基础.方法采用酶消化法,获取组织及细胞悬液,经密度梯度离心后,获得较高产量微血管内皮细胞,并进行体外培养.进一步对人胎盘微血管内皮细胞进行免疫细胞化学法的Ⅷ因子相关抗原及CD34鉴定,用透射电镜观察细胞质Weibel-Palade小体.结果体外培养出纯度较高的微血管内皮细胞并培养了3～5代.此外,免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原及CD34表达阳性,电镜下观察到Weibel-Palade小体.结论成功分离并培养人胎盘微血管内皮细胞.     

大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养

目的探讨一种分离和培养大鼠肺微血管内皮细胞(LMVEC)的简单方法。方法组织贴块法培养大鼠LMVEC,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性,并采用免疫组化方法进行鉴定。结果获得的LMVEC具有规律的铺路石镶嵌状排列,内皮细胞特异性抗体CD31免疫组化染色阳性。结论组织贴块法培养LMVEC是简单可行的。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

贯叶连翘提取物对百草枯所致的急性肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨贯叶连翘提取物（HP）在百草枯（PQ）诱导的大鼠肺微血管内皮细胞（rPMVECs）急性损伤中的作用和对活性氧族物质（ROS）产生的影响。方法原代培养rPMVECs,分为PQ中毒组、HP干预组以及空白对照组。同时向PQ中毒组和HP干预组加入PQ溶液（0．1mmol／L）0．5h后开始计时,再向HP干预组分别添加三种不同浓度的HP溶液（250mg／L、10mg／L、1mg／L）。采用四氮唑盐（MTT）比色法观察不同时同点（3、12、24、48、72h）和不同浓度的HP对rPMVECs生长抑制率的影响,同时用分光光度比色法测定相应的细胞上清液中总超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果在0．1mmol／L的PQ诱导rPMVECs损伤后,随着HP浓度的增高和作用时间的增长,HP可明显减缓rPMVECs生长抑制率的升高;三种浓度的HP几乎在各个时同点均能明显减缓总SOD的活力的下降（P〈0．05）;72h时,三种浓度的HP均能明显减缓MDA含量的增加（P〈0．05）,而在其它时间点,三种浓度的HP几乎不能明显减缓MDA含量的增加。结论HP对PQ诱导的急性rPMVECs损伤具有保护作用。     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

新生大鼠心脏微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:介绍一种改良的心脏微血管内皮细胞(CMECs)的分离培养及鉴定方法。方法:应用酶消化法分离大鼠CMECs,再用差速贴壁进行纯化。结果:用光学显微境、免疫细胞化学法进行第Ⅷ因子相关抗原染色来鉴定CMECs,其纯度约98%。结论:该法简单且经济。     

In Vitro Formation of Capillary-like Structures by Co-culturing Fibroblasts and Microvascular Endothelial Cells

Objective To investigate the in vitro formation of capillary-like structures formation by co-culturing fibroblasts with microvascular endothelial cells. Methods The Sprague-Dawley （SD） rat microvascular endothelial cells （RMVECS） and fibroblasts were firstly isolated, cultured and identified. After which, the second passsge of RMVECs and fibroblasts were mixed at a ratio of 1：2, and co-cultured for 12 days. Meanwhile, RMVECs or fibroblasts were cultured respectively as control. Results In vitro cultured RMVECs exhibited typical cobblestone morphology and immunocytochemistry analysis showed that the RMVECs were Factor Ⅷ positive. Transmission Electron Microscopy （TEM） demonstrated that specific endothelial organeUe （Weibel-Palade bodies） can be found in RMVECs. In addition, the in vitro cultured fibroblasts exhibited a typical spindle appearance and immunocytochemistry analysis showed that the fibroblasts were Vimentin positive. After co-culture for 12 days, capillary-like structures were formed, while no similar structures were observed in two control groups. Further immunocytochemistry analysis showed that the cells of the capillary-like structure were Factor Ⅷ positive. Conclusion By co-culturing fibroblasts with RMVECs, capillary-like structure can be formed. This novel method might cast a new light on the realization of vascurlarization for tissue engineering products.     

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物（ＴＰＡ）活性测定。方法 取新生小鼠脑组织,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底时,用０．１２５％胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化,离心收集内皮细胞,进行传代培养。原代、传代各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果 经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定