外周血维生素D3在原发性干燥综合征患者中的表达及与病情程度的关系

目的：探讨25（OH）D3在原发性干燥综合征患者中的表达及与病情程度的关系。方法：收集2015年3月至2016年3月于我院就诊的98例原发性干燥综合征患者。按照SSDAI积分分为pSS稳定期组（n=49例）和pSS活动期组（n=49例）,同期选择98例在我院体检的健康志愿者作为对照组。采集所有实验者的B淋巴细胞指标（CD27^high浆细胞、CD27⁺记忆性B细胞）和T淋巴细胞指标肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-6、IL-10、IL-17,检测并分析。采用ELISA法检测维生素D3的水平。观察pSS组和对照组B淋巴细胞指标、T淋巴细胞指标对比,pSS活动期组和pSS稳定期组B淋巴细胞指标、T淋巴细胞指标对比。结果：在B淋巴细胞中,pSS组CD27^high浆细胞、CD27+记忆性B细胞显著低于对照组［（0.87±0.23）vs（1.80±0.20）,（21.75±4.32）vs（33.92±3.19）］（P＜0.05）,在T淋巴细胞指标中,pSS组TNF-α、IL-6、IL-17水平显著高于对照组［（135.89±15.83）μg/L vs（69.03±11.07）μg/L,（98.52±20.17）μg/L vs（40.02±9.42）μg/L,（89.36±16.26）μg/L vs（45.92±9.01）μg/L］（P＜0.05）,IL-10水平显著低于对照组［（46.16±17.05）μg/L vs（9689±10.37）μg/L］（P＜0.05）;在B淋巴细胞中,pSS活动期组CD27high浆细胞、CD27+记忆性B细胞显著低于pSS稳定期组［（0.70±0.10）vs（1.23±0.30）,（17.04±1.90）vs（25.10±2.80）］（P＜0.05）,在T淋巴细胞指标中,pSS活动期组TNF-α、IL-6、IL-17水平显著高于pSS稳定期组［（205.86±28.98）μg/L vs（124.57±16.04）,（114.02±20.73）μg/L vs（81.98±7.40）μg/L,（101.86±15.97）μg/L vs（76.39±4.53）］μg/L（P＜0.05）,IL-10水平显著低于pSS稳定期组［（31.92±8.09）μg/L vs（60.86±6.18）μg/L］（P＜0.05）,pSS活动组为(22.45±3.27)pg/ml,pSS稳定组为(39.03±3.21)pg/ml,对照组为(41.64±5.59）pg/ml。活动组25(OH)D3 水平低于稳定组和对照组(P＜0.05),但稳定组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：原发性干燥综合征患者25（OH）D3水平显著低于正常人,25(OH)D3的不足可使T淋巴细胞和B淋巴细胞浸润及活化,造成腺体功能损伤,与原发性干燥综合征的病情程度以及免疫功能之间存在密切的关系。     

脂多糖活化的大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α产生的新机制

目的：探讨脂多糖（LPS）活化的肺泡巨噬细胞中低氧诱导因子－1α（HIF-1α）的表达及其在肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α（TNF-α）中的作用。 方法： 应用HIF-1α 诱骗法（HIF-1α decoy）抑制其作用，并用Western blotting、半定量RT-PCR、酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测HIF-1α蛋白、mRNA的表达和TNF-α的产生。 结果： HIF-1α蛋白含量在LPS组（1.95±0.57）和HIF-1α decoy组（1.89±0.59）均明显高于对照组（0.41±0.14，P＜0.05）；HIF-1α mRNA的表达在对照组（0.7838±0.3183）、LPS组（0.7622±0.3387）和HIF-1α decoy组（0.8155±0.3594）之间无显著差异（P>0.05）；LPS刺激24 h后，大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α的产生明显高于对照组（61 ng/L vs 156 ng/L, P<0.05），抑制HIF-1α后TNF-α的产生明显低于LPS刺激组（90 ng/L vs 156 ng/L, P<0.05），但 HIF-1α decoy组TNF-α的产生仍然高于对照组（61 ng/L vs 94 ng/L, P<0.05）。 结论： 大鼠肺泡巨噬细胞在LPS的刺激下HIF-1α蛋白的稳定性增强使其表达明显上调，并且促进TNF-α的产生，提示HIF-1α在肺部慢性炎症性疾病如COPD的发病机制中可能有重要作用。     

STAT3活化在脂多糖刺激大鼠胆管上皮细胞增殖中的作用

目的：探讨脂多糖(LPS)刺激大鼠肝内胆管上皮细胞（BEC）增殖过程中信号转导和转录激活因子3（STAT3）活化的意义。方法：大鼠随机分为对照组(control)、LPS组和雷帕霉素（RPM）处理组。分别于注射LPS后6、12、24、48和72 h采用动态比浊法鲎试验测定血浆LPS水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测肝组织匀浆IL-6水平，激光扫描共聚焦显微镜（LSM）检测BEC内磷酸化STAT3(p- STAT3)水平，免疫组织化学法检测BEC增殖。结果:大鼠注射LPS后6 h血浆LPS水平最高［（318±115） EU/L］，48 h接近control组水平［(29±11) EU/L］；IL-6 水平于注射LPS后12 h达峰值［(653.4±168.8) ng/g蛋白］，72 h接近control组水平［（249.4±50.7）ng/g蛋白］，LPS组BEC内p-STAT3的表达与IL-6水平呈显著正相关(r=0.944，P<0.05)；BEC增殖指数在12 h明显增加［（5.2±0.5）%］，24 h达到峰值［（12.8±3.0）%］，72 h接近control组水平［（4.2%±0.6%）］；给予RPM明显减轻LPS诱导的细胞STAT3活化和BEC增殖。结论:LPS刺激导致肝组织IL-6分泌增加，后者可能通过STAT3介导BEC增殖。     

NT-3促进脂多糖诱导的M1型巨噬细胞向M2表型极化

目的探讨神经营养素-3(NT-3)能否促进脂多糖(LPS)诱导的M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。方法体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞株,分为LPS组和LPS+NT-3组。用脂多糖(100 ng/ml)刺激12h后,撤掉LPS培养基,冲洗,分别加入基础培养基和含有NT-3(40 ng/ml)的基础培养基,培养24 h后,全部置换成基础培养基培养24 h,收集上清与细胞。固定后的细胞分别做CD68/CCR7(M1型细胞标记物)、CD68/CD206(M2型细胞标记物)、CD68/Trk C免疫荧光双标染色。用酶联吸附试验(ELISA)检测上清中TNF-α和IL-10水平。结果免疫荧光细胞化学染色显示,LPS刺激后的巨噬细胞表达NT-3的受体Trk C。LPS组可观察到较多的M1型细胞和较少的M2型细胞。LPS+NT-3组可观察到M1型细胞数减少,而M2型细胞数增多。与LPS组比较,LPS+NT-3组的M1型巨噬细胞比例降低,同时M2型巨噬细胞比例增加(P<0.01)。ELISA结果显示,与LPS组比较,LPS+NT-3组上清中TNF-α的水平明显下降(P<0.01),IL-10的水平相对升高但是差异不明显(P>0.05)。结论 NT-3促进M1型巨噬细胞向M2型极化可能通过与其受体Trk C结合发挥作用,进而减少促炎因子TNF-α的分泌。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

小鼠骨髓源性巨噬细胞极化的体外诱导方法探究

目的:探究小鼠骨髓前体细胞体外诱导成为不同极化状态(M1和M2)巨噬细胞的优化方法。方法:健康C57BL/6小鼠麻醉处死,收集其股骨和胫骨腔内容物,经筛网过滤、红细胞裂解后,在RPMI-1640完全培养基中培养16h,收集未贴壁的骨髓前体细胞重新接种于6孔板。根据培养基中所加刺激剂的种类、剂量不同进行实验分组,于不同时点收集细胞,光镜下观察各组细胞形态学变化,流式细胞术及RT-qPCR检测不同极化状态巨噬细胞的相应标志物。结果:(1)小鼠骨髓前体细胞经50μg/L巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激72 h后,CD11b阳染率达到90%以上;刺激96 h后,F4/80的阳染率达到95%以上。40μg/L的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激96 h后,CD11b阳染率也达到了90%以上,F4/80阳染率至144 h达到峰值(58.2%);(2)在M-CSF刺激所得单核-巨噬细胞的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂(25μg/L LPS和10μg/L IFN-γ)刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;给予M2型巨噬细胞诱导剂(20μg/L IL-4和IL-13)刺激后CD206的阳染率始终处于较低水平(10%左右);(3)在GM-CSF刺激的基础上,给予M1型巨噬细胞诱导剂刺激24 h,可见CD86的阳染率大于90%;而当细胞接受M2型巨噬细胞诱导剂刺激96 h,CD206的阳染率达68.98%;(4)RT-qPCR结果显示在给予相应极化诱导剂刺激后,M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-12,以及M2型巨噬细胞标志物:几丁质酶3样蛋白3(Chi3l3/Ym1)、甘露糖受体(MR)和精氨酸酶1(Arg-1)的mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。结论:(1)C57BL/6小鼠骨髓前体细胞受到M-CSF或GM-CSF诱导后90%以上细胞均可向单核细胞分化,M-CSF可诱导90%以上的细胞为成熟巨噬细胞,GM-CSF可诱导58%的细胞为成熟巨噬细胞;(2)在M-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,但联合IL-4和IL-13难以获得M2型巨噬细胞;(3)在GM-CSF前期诱导的基础上,联合LPS和IFN-γ易于诱导出M1型巨噬细胞,联合IL-4和IL-13也可将大部分细胞诱导成为M2型巨噬细胞。     

α7nAChR参与生理浓度糖皮质激素的抗炎作用*

 目的： 探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）在生理浓度糖皮质激素（GCs）抗炎过程中的作用。方法: MTT法检测不同浓度氢化可的松对小胶质细胞BV-2活性的影响;在建立LPS刺激的BV-2细胞炎症模型基础上,实验分组如下：(1) 空白对照组;(2) LPS组;(3) GCs＋LPS组;(4) α7nAChR阻断剂甲基牛扁亭碱（MLA）＋GCs＋LPS组,ELISA法测定细胞上清中TNF-α和IL-1β的含量。结果: 2 000 和1 000 nmol/L 氢化可的松可分别使细胞存活率降低至(76.9±5.5)%和(90.8±7.3)%,表现出超生理剂量GCs的细胞损伤作用。LPS明显刺激BV-2细胞释放TNF-α和IL-1β,并呈现时间和剂量依赖性。生理浓度（500和250 nmol/L）的氢化可的松均可减少LPS诱导BV-2细胞释放TNF-α和IL-1β,10 nmol/L MLA预处理BV-2细胞能拮抗GCs抑制炎症因子释放的作用。结论: α7nAChR参与了生理浓度GCs的抗炎作用。     

肝细胞癌患者树突状细胞免疫功能的研究

 目的：研究肝细胞癌患者树突状细胞(DCs)的免疫功能变化。方法：从人外周血中分离单个核细胞（PBMC），用GM-CSF和IL-4体外诱导、培养和扩增DCs，流式细胞仪测定DCs表面分子的表达，分别用ELISA、ELISPOT、MTT法测定HCC患者和健康人的DCs分泌IL-12；T淋巴细胞分泌IFN-γ和T淋巴细胞的增殖反应。结果：GM-CSF和IL-4能成功地体外诱导、培养和扩增DCs。HCC患者DCs的CD86表达明显低于健康对照者（91.7％ vs83.5%, P<0.05）。HCC患者DCs分泌IL-12与健康者差异不显著［（324.6±171.0）ng/L vs（436.5±142.7）ng/L, P>0.05］，接受内毒素LPS刺激后，差异更明显［（478.6±142.7）ng/L vs（630.0±151.9）ng/L, P<0.05］。DCs刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ 的量在HCC患者明显低于健康者［（133.4±51.2）103U/L vs (183.0± 60.2)103U/L, P<0.05］，DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力在HCC患者明显低于健康者（2.3±0.7 vs3.5±0.8, P<0.01）。CTL杀伤实验表明，当效靶比为 10∶〖KG-*2〗1 和 20∶〖KG-*2〗1 时，HCC组的CTL对肝癌细胞Hep G2的杀伤活性明显低于健康组。结论： HCC患者DCs功能和T淋巴细胞功能低于健康者，HCC患者DCs诱导的CTL杀伤活性亦明显低于健康者。     

肾上腺素对小鼠巨噬细胞中促炎／抗炎介质比值的影响

目的：研究肾上腺素对脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7中促炎介质［肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、环加氧酶-2（COX-2）］和抗炎介质［血红素氧化酶-1（HO-1）、白介素10（IL-10）］表达及NF-κB活化的影响。 方法： 以10 μg/L的LPS刺激体外培养的RAW264.7细胞作为炎症模型，加入不同浓度的肾上腺素（1、5、10、50 μmol/L）孵育24 h后，收集培养上清并提取细胞总蛋白，酶联免疫法测定上清中TNF-α、IL-10浓度，Griess法检测上清NO含量(以NO2-/NO3-表示)，免疫印迹法检测细胞总蛋白中COX-2、HO-1、IκB-α的含量。 结果： 10 μg/L的LPS明显诱导TNF-α、NO(NO2-/NO3-)、COX-2、IL-10及HO-1的产生；LPS+肾上腺素组与LPS单独作用组相比促炎介质TNF-α、NO(NO2-/NO3-)、COX-2的表达量显著下降，而抗炎介质IL-10、HO-1的表达却明显增强；肾上腺素与LPS共同作用组中IκB-α的含量与单独LPS作用组相比无明显差异。 结论： 肾上腺素下调LPS诱导的巨噬细胞中促炎介质的表达同时促进抗炎介质的表达，这种效应并不通过影响NF-κB的活化来实现。     

Th17和Treg细胞以及其相关细胞因子在慢性丙型肝炎以及丙型肝炎肝硬化病人外周血中的变化及意义

目的：〖HTSS〗研究Th17和Treg细胞以及其相关细胞因子在慢性丙型肝炎以及丙型肝炎肝硬化病人外周血中的变化及意义,以探讨其在慢性丙型肝炎及丙型肝炎肝硬化发病中的作用。 〖HTH〗方法：〖HTSS〗用流式细胞和ELSIA技术检测慢性丙型肝炎及丙型肝炎肝硬化病人外周血Th17和Treg细胞表达率以及IL 6、IL 10、TGF β、IL 17血清学水平,分析上述指标在健康对照组和慢性丙型肝炎组以及肝硬化组之间的差异。 〖HTH〗结果：〖HTSS〗慢性丙型肝炎病人的Th17细胞表达率(133%±030%)以及IL 6［(810±242）ng/L］、IL 17［(1670±473）ng/L］血清水平明显高于健康对照组Th17 细胞表达率(114%±019%)以及IL 6［(670±172）ng/L］、IL 17［(1229±188）ng/L］血清水平,P＜005;丙型肝炎肝硬化组和慢性丙型肝炎组病人外周血的Treg细胞表达率(621%±076%,589%±085%)明显高于健康对照组的Treg细胞表达率（551%±059%）,P<005;丙型肝炎肝硬化组病人Th17/Treg的比值（019±002）明显低于慢性丙型肝炎组（022±003）和健康对照组（021±003）,P<005;丙型肝炎肝硬化组外周血IL 10水平［（1621±376）ng/L］和TGF β水平［（515±083）ng/L］显著高于慢性丙型肝炎组［（1436±278）ng/L;（447±087）ng/L］和健康对照组［（1401±301）ng/L;（443±098）ng/L］,P<005。 〖HTH〗结论：〖HTSS〗Th17和Treg细胞以及其相关细胞因子参与了丙型肝炎慢性化和肝硬化的进程,Th17和Treg细胞以及其相关细胞因子在丙型肝炎慢性化和肝硬化的治疗和预防方面可能具有重要的意义。     

M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析

通过对M1和M2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析,评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方法以IFN-γ及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL-4诱导出M2型巨噬细胞。分别以RT-PCR和酶活性定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性;以ELISA检测IL-12和IL-10的分泌;以FACS检测巨噬细胞膜分子的表达。结果显示:M1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达和活性水平较未刺激组明显升高,IL-12产生显著增加,CD16/32表达上调;而M2型巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase 1,Arg-1)的表达水平和酶活性较未刺激巨噬细胞显著提高,IL-10分泌轻度增加,并且表达高水平的CD206和DECTIN-1。表型比较分析结果表明,iN-OS表达和活性、IL-12的分泌和膜蛋白CD16/32可用于鉴定M1型巨噬细胞,而Arg-1、CD206和DECTIN-1是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的表型指标。     

牛磺酸减轻内毒素诱导的大鼠心肌损伤

目的:探讨牛磺酸对内毒素(即脂多糖,LPS)诱导的大鼠心肌损伤的影响。方法:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只随机分为3组:正常对照组、内毒素模型组及牛磺酸处理组。正常对照组和内毒素模型组大鼠尾静脉注射生理盐水,牛磺酸处理组大鼠尾静脉注射牛磺酸(100 mg/kg),2 h后,内毒素模型组和牛磺酸处理组大鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg),正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水。注射内毒素6 h后,采集血样品和心肌组织,检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)水平;光镜下观察心肌形态学变化;Western blot检测心肌组织磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、环氧合酶2(COX-2)、TNF-α、IL-6及血红素加氧酶1(HO-1)的表达。结果:与正常对照组比较,内毒素模型组大鼠血清SOD活性及心肌组织HO-1表达明显降低(P0.01),血清MDA、TNF-α和IL-6水平明显升高(P0.01),心肌组织p-NF-κB、COX-2、TNF-α及IL-6水平明显升高(P0.01)。与内毒素模型组比较,牛磺酸处理组大鼠血清MDA、TNF-α和IL-6水平明显降低(P0.01),牛磺酸处理明显降低心肌组织COX-2、TNF-α、IL-6及p-NF-κB水平(P0.01),血清SOD活性及心肌组织HO-1表达明显提高(P0.01)。组织学观察显示内毒素模型组大鼠心肌组织有炎症细胞浸润,心肌纤维排列疏松不规则,而正常对照组和牛磺酸处理组大鼠心肌纤维排列整齐规则。结论:牛磺酸预处理能减轻内毒素诱导的心肌损伤,其机制可能通过HO-1/CO信号下调p-NF-κB/COX-2而发挥作用。     

雾化吸入γ-干扰素增强肺部细胞免疫功能的研究

目的:研究雾化吸入γ-干扰素(IFN-γ)对免疫低下宿主肺部抗感染能力的增强作用。方法:对气管内注射白色念珠菌和白色念珠菌并雾化吸入IFN-γ(1、3、7d)的免疫低下大鼠,检测其血液和肺局部细胞免疫指标,并于第7d检测左肺白色念珠菌培养计数。结果:雾化吸入γ-干扰素组肺白色念珠菌计数显著少于免疫低下组,AM吞噬及杀菌百分率、Ia抗原表达的阳性率显著高于免疫低下组,AM培养上清TNF-α活性和IL-1β、IL-6水平显著高于免疫低下组,BALF中IFN-γ、TNF-α活性高于免疫低下组(第7dTNF-α除外),灌菌后第7天肺组织IFN-γ和IL-1β表达高于免疫低下组,TNF-α表达低于免疫低下组,IL-6表达两组间无显著差异。雾化吸入IFN-γ组血清IFN-γ活性和IL-1β、IL-6水平(除第3dIL-1β外),与免疫低下组无显著差异,且感染后第7d血淋巴细胞杀伤功能与免疫低下组无显著差异。结论:雾化吸入γ-干扰素可明显增强免疫低下大鼠肺部细胞免疫和抗感染能力,但对全身细胞免疫状态无明显影响。     

脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。     

M1/M2型巨噬细胞极化参与肾组织炎症损伤和修复进程

目的:研究M1/M2型巨噬细胞在肾组织炎症损伤和修复进程中的分布趋势及作用。方法:将45只雄性SD大鼠随机分为缺血再灌注损伤(IRI)组和单侧输尿管梗阻(UUO)组两部分。IRI组分为假手术(sham)组及术后0、6、24和72 h组;UUO组分为sham组及梗阻3、7和14 d组;每个时相5只大鼠。全自动生化分析仪检测血肌酐和尿素氮水平;HE与免疫组织化学染色分别观察肾组织损伤及CD68的表达;流式细胞术检测M1(CD68+、F4/80+和CD16/32+)和M2(CD68+、F4/80+和CD206+)型巨噬细胞的分布;ELISA检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:IRI早期,肾组织损伤程度随再灌时间延长而加剧,并与CD68+巨噬细胞浸润呈一致性变化趋势;至24 h,组织损伤与巨噬细胞浸润最为严重;但之后随时间延长,损伤和巨噬细胞浸润反而减轻。UUO组中,肾损伤随梗阻时间延长而加剧,14d时纤维化明显;而巨噬细胞浸润第7天最为严重,之后又有减轻。流式细胞术分析显示IRI和UUO损伤早期浸润的巨噬细胞以M1型为主,i NOS表达较高;IRI和UUO损伤后期巨噬细胞均向M2型极化,Arg-1水平明显增加;巨噬细胞这种变化趋势与肾组织在不同时间节点出现损伤与修复表征存在明显相关性。深入分析发现,M1型巨噬细胞可通过诱导TNF-α高表达促进早期炎症损伤,M2型巨噬细胞通过提高TGF-β1水平促进后期纤维增生性修复。结论:UUO和IRI过程中均存在巨噬细胞极化:M1型巨噬细胞可诱导早期损伤,M2型巨噬细胞则参与损伤后期的纤维性修复。M1和M2型巨噬细胞在损伤修复过程中的极化特征可为临床治疗提供指导。     

NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响

 目的： 探讨NOD8对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞释放一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的影响。方法： pEGFP-C2及pEGFP-NOD8重组质粒分别转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以LPS刺激RAW264.7细胞0、6、12、24 h后,采用Griess reagent法测定观察细胞分泌的NO水平;ELISA法检测IL-1β 和 TNF-α 的含量;荧光法测定活化的caspase-1水平; Western blotting检测NOD8蛋白表达及NF-κB  p65亚基的核转位情况。结果： (1)与转染pEGFP-C2空质粒组比较,转染pEGFP-NOD8质粒组NOD8蛋白表达明显增加。(2) LPS刺激6、12、24 h后,RAW264.7细胞释放NO、IL-1β及TNF-α均明显增加;而在pEGFP-NOD8+LPS组RAW264.7细胞, NO于12、24 h 的释放显著降低,IL-1β于6、12、24 h的释放也明显降低,TNF-α的释放则无明显变化。（3）在LPS刺激6、12、24 h后, RAW264.7细胞caspase-1活化水平均明显升高,胞浆NF-κB p65亚基表达明显减少,表明p65核转位增加;而pEGFP-NOD8+LPS组可显著抑制caspase-1的活化以及NF-κB p65亚基的核转位,差异有统计学意义。结论： NOD8可抑制LPS诱导的巨噬细胞NO与IL-1β释放,其作用机制可能与NOD8抑制caspase-1及NF-κB 的活化有关。     

TLR4在LPS诱导的结肠炎症恢复中的作用

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)在结肠炎症中的作用,探讨LPS在炎症性肠病中的治疗作用。方法:取正常肠上皮细胞进行体外脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预培养。采用慢病毒转染技术,构建TLR4低表达、正常表达及高表达的肠上皮细胞亚组。正常表达组(normal组)及高表达组(high组)培养基中加入LPS诱导细胞炎症,刺激时间分别为0、2、4 h。Western blot法检测TLR4的表达;收集细胞上清液,ELISA检测各亚组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平。收集细胞,qPCR检测细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1βmRNA的表达水平。划痕试验观察对比2组细胞的迁移能力。结果:LPS干预培养细胞后,TLR4的表达量显著增加(P0.05)。ELISA和qPCR检测高表达组与正常表达组组间细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β的蛋白和mRNA水平的差异均有统计学意义(P0.05)。划痕试验提示TLR4高表达组的细胞迁移能力明显高于正常对照组。结论:LPS影响TLR4炎症通路的活化,促进前炎症因子及辅助刺激分子的释放,起到调节炎症反应的作用。     

骨髓来源间充质干细胞培养上清液减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

 目的:观察经尾静脉输注骨髓间充质干细胞培养上清液（MSCs CdM）对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤的治疗作用及其机制。方法:采用全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代时观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志,并且收集上清液用超滤离心管进行离心。30只BALB/c小鼠随机分为对照组、 LPS模型组和MSCs CdM治疗组。对照组腹腔内注射生理盐水（0.01 mL/g）,LPS组和MSCs CdM治疗组腹腔内注射LPS（5 mg/kg,0.01 mL/g）制备急性肺损伤模型。造模1 h后经尾静脉输注MSCs CdM（MSCs  CdM治疗组）或生理盐水 （LPS组或对照组）300 μL。6 h后处死小鼠,留取标本检测肺组织病理形态学、肺组织湿干重比（W/D）、支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量、血清及BALF中细胞因子水平和肺组织中髓过氧化物酶(MPO)的活性。结果:与对照组比较,LPS处理后肺组织病理损伤严重,BALF中蛋白、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量、肺组织中MPO活性及肺组织湿干重比均显著升高。与LPS组比较,MSCs CdM治疗组肺组织病理损伤程度减轻,BALF中蛋白、血清TNF-α和IL-6含量、肺组织中MPO活性及肺组织湿干重比均显著降低,而BALF中白细胞介素10（IL-10）和角质细胞生长因子（KGF）水平显著高于LPS组和对照组。结论:骨髓间充质干细胞培养上清液可有效减轻LPS诱导的急性肺损伤,其作用机制可能与其调节肺部TNF-α、IL-6、IL-10和KGF的水平有关。