兔骨保护素全长基因的获取

获得兔骨保护素(OPG)基因并分析序列。从兔肱骨中提取总RNA,逆转录形成cDNA,用5′RACE策略扩增OPG基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,并测序及进行序列分析。兔OPG基因全长1 540bp,编码400个氨基酸,与人OPG氨基酸序列相比,同源性为89%,而与大鼠等其它动物的同源性则在85%左右。5′RACE法成功获得了兔OPG基因的真实序列,为OPG基因的功能研究奠定了良好基础。     

牛IL-18基因的克隆及遗传进化分析

目的：克隆牛白细胞介素18（IL-18）全基因，并对其进行序列分析。方法：从ConA刺激培养的牛外周血淋巴细胞提取总RNA，利用巢式RT-PCR方法扩增出牛IL-18全长cDNA，将其克隆到pMDl8-T载体上，测序后进行序列分析。结果：成功地克隆到了牛IL-18全基因，序列分析表明，实验中所克隆到的牛IL-18序列与GeneBank所登录的牛IL-18核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99．5％和99％。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84．9％-99．5％和74．9％～99％之间，研究结果在国内还未见报道。结论：成功地从牛外周血中克隆到了牛IL-18的基因，其全长为598bp。     

藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区的克隆及序列分析

目的:克隆藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区,并进行序列分析。方法:从藏羚羊肝组织中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出血红素氧合酶-1(HO-1)基因编码区cDNA片段,与载体连接构建重组质粒,经转化、扩增培养、鉴定后测序,测序结果利用生物信息学的方法进行分析。结果:藏羚羊HO-1基因编码区长度为897,编码298个氨基酸(GenBank登录号为:JQ809687);序列分析表明,藏羚羊HO-1基因的编码区序列与脊椎动物山羊和牛的相似性分别达到98%和96%,氨基酸序列相似性分别达到92%和97%,与其它脊椎动物HO-1基因的核苷酸及氨基酸序列相似性达到86%和87%以上,显示出高度保守性。构建的基于氨基酸序列的分子系统进化树聚类结果表明,藏羚羊与山羊的进化距离最近。结论:本研究成功地克隆出藏羚羊HO-1基因编码区序列,为从低氧细胞保护角度探讨青藏高原土著物种适应高原的分子生物学机制研究提供实验依据。     

广州检出星状病毒4型的全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的星状病毒基因组分子结构特点和基因型.方法 参考GenBank上的星状病毒基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增星状病毒基因组,克隆于T载体上,序列测定,用Clustal W和DNAStar软件分析基因组序列.结果 星状病毒HASTVgz01全基因组为6721 bp,提交到GenBank上的序列号为DQ344027,其中5＇端非编码区（5＇UTR）长82bp,3＇端非编码区末端长81 bp,病毒基因组编码区全长6558个核苷酸,分别编码ORF1a、ORF1b、ORF2,ORF1a基因长2763 bp（83～2845 nt）,ORF1b基因长1557bp（2785～4332 nt）,其中ORF1a、ORF1b两基因有71个核苷酸的重叠区;ORF2全长2316 nt,位于基因组中4325～6640 nt.ASTVgz01与GenBank中8种基因型星状病毒的ORF2基因氨基酸序列同源性比较发现,HASTVgz01与4型的同源性为93%,其他的同源性在61%～70%之间.结论 广州地区儿童腹泻感染的星状病毒HASTVgz01全基因组为6721bp,GenBank序列号为DQ344027,HASTVgz01与4型星状病毒的ORF2基因氨基酸序列比较同源性为最高,确认HASTVgz01是4型星状病毒.     

卵黄萤荧光素再生酶基因的克隆与序列分析

目的克隆和分析荧光素再生酶基因（LRE）。方法通过GeneBank中已知的荧光素再生酶基因保守区段设计引物,利用5’RACE（rapid-amplification of cDNA ends）和3’RACE技术克隆了来自云南省西双版纳州的卵黄萤（Luciola ovalis）荧光素再生酶基因cDNA和全基因序列。通过GeneBank、National Center for Biotechnology Information和ProDom at the ExPASy Server软件和数据库进行序列分析。结果卵黄萤荧光素再生酶的cDNA序列和基因序列存在2个不同碱基位点,但是它们编码的荧光素再生酶是相同的。卵黄萤荧光素再生酶基因全长（从起始密码子到终止密码子）为1131bp,包含5个外显子4个内含子,其cDNA序列为1008bp,包含924bp的荧光素酶基因开放阅读框和84bp的3’UTR序列。卵黄萤荧光素酶基因的开放阅读框编码1个307个氨基酸的蛋白质。它与北美萤火虫（Photinus pyralis）荧光素再生酶在碱基序列和氨基酸序列上分别有61.8%和53.3%的相似性。结论成功地克隆了荧光素再生酶的cDNA和基因序列,为其在基因工程中的应用奠定了基础。     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列，对比不同毒力弓形虫株（PRU、RH、ME49）中SAG2C基因序列。进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物，应用PCR技术从Prugniaud（PRU）株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因，克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站（http：／／www。ncbi．nlm．nih.gov／）分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性；利用生物信息学网站ExPASy（http：／／us.expasy．org／）对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列．酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明，获得SAG2C基因序列1225bp，全长cDNA序列1095bp，编码364个氨基酸。同源性分析显示。弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97．14％；Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96．89％；编码氨基酸序列同源性为92％。N端为信号肽，C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白．存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列。序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。     

不同基因型HCV膜区（E2）基因克隆及亲、疏水性分析

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）不同基因型膜区序列变异及其变异规律。方法 克隆不同基因型HCV的膜区基因,序列测定,核苷酸和氨基酸序列比较和分析。结果 不同基因型膜区基因相似性不同,从同一血清样本获得的不同克隆间,其同源性核苷酸大于99．2％,氨基酸大于99．9％。相同亚型核苷酸和氨基酸同源性大于80％。同型基因核苷酸和氨基酸同源性分别为（63．9－75．0）％和（64．9－72．8）％。异型基因同源性核苷酸为（59．4－67．0）％,氨基酸为（56．5－66．3）％。氨基酸序列变化在某些部位有一定保守性。不同基因HCV高变区（HVR）的亲水性和疏水性变化小于其下游3′端区域。结论 HCV基因变化可能有一定规律性。     

斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的　克隆斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并对其进行测序和序列分析。方法　利用简并引物 ,进行RT PCR ,扩增斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果　RT PCR扩增出了一约5 0 0bp的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 95bp。将推导的氨基酸序列作同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着较高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论　克隆获得了斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。     

诺如病毒广州株全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的诺如病毒基因组分子结构特点和基因组类型。方法 参考GenBank上的诺如病毒MD145-12基因组设计分段扩增引物，进行RT-PCR分段扩增诺如病毒基因组，克隆于T载体上，测定序列，用Clustal W／X、DNAStar、RAT（recombination analysis tool）等软件分析基因组序列。结果 诺如病毒NVgz01全基因组为7558bp，提交到C,enBank上的序列号为DQ369797，3’端非编码区末端长45bp，病毒基因组有3个开放阅读框（ORF），ORF1长5100bp（5～5104nt），ORF2基因长1623bp，位于基因组中5085～6707nt之间，ORF3基因长807bp（6707～7513nt），其中ORF1、ORF2两基因有19个核苷酸的重叠区；NVgz01全基因组核苷酸序列与GenBank上诺如GI组Norwalk68、Southampto、BS5、Chiba、WUG1的同源相似性在43％～44％之间，与GⅡ组MD145、Farmington　Hills、B4S5、Hawaii、Lordsdale、SaitamaU1、Mc37同源相似性在76％～90％之间。NVgz01的ORF1与Mc37核苷酸序列同源性为94％，但ORF2与Mc37的同源性只有65％；NVgz01的ORF2与Fannillgton Hills（AY502023）同源性为最高（94％），ORF1的同源性为88％。结论广州地区儿童腹泻感染的诺如病毒NVgz01株全基因组序列为7558bp，GenBank序列号为DQ369797，NVgz01与诺如病毒的GⅡ组同源性较高，确认NVgz01株属于诺如病毒GⅡ组；根据ORF1、ORF2的同源性差异和RAT程序分析初步认为NVgz01可能是重组病毒。     

原生动物阴道毛滴虫的酵酶长寿保障基因LAG1同源基因克隆和序列分析

为了探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老相关基因,作者从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出一具910碱基对的cDNA克隆,其编码框长834 bp,推测蛋白质序列有277个氨基酸.序列分析显示该克隆与酵酶长寿保障基因LAG1同源性最高,其氨基酸序列中含有LAG1及其同源基因保守的Lag1结构域和TLC结构域以及6个跨膜螺旋区和一个C-未端的内质网保留信号域.因此推测该克隆系酵酶LAG1的同源基因,该基因可能参与阴道毛滴虫的神经酰胺生物合成以及调解细胞的生命期或细胞衰老.该基因的基因组DNA与其cDNA序列一致,提示该基因序列中可能无内含子.     

5′和3′末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法采用末端快速扩增法(RACE),进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAP2同源性高达99%以上。该序列具有较短的5′非翻译区及长的3′非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly(A)尾。结论利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAP2全长cDNA。     

肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段的验证及全长序列的克隆

目的： 对肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段（已知序列）进行验证,并克隆其全长cDNA序列。方法: 采用RT-PCR和末端快速扩增技术(RACE),对正常人肺组织中HLCDG1基因片段进行验证和克隆其全长cDNA序列,登录基因数据库进行比对分析。结果: 从正常人肺组织中钓取到HLCDG1基因未知的3’端和5’端序列分别为1 304 bp和1 548 bp。HLCDG1基因与人酪蛋白激酶Ⅰα（CSNK1A1）基因2号转录变体相似性达99%,score=5 544,E=0。结论: HLCDG1基因为已知的CSNK1A1基因的2号转录变体,可能参与肺癌发生发展。     

Genetic diversity at the hinge region of the unique immunoglobulin heavy gamma (IGHG) gene in leporids (Oryctolagus, Sylvilagus and Lepus)

Unlike other species, European rabbit (Oryctolagus cuniculus) possesses only one immunoglobulin gamma class. Allelic diversity at the Ig (immunoglobulin) gamma constant region encoded by the unique IGHG (immunoglobulin heavy gamma) gene is moreover much reduced. In the European rabbit, the genetic variation at IGGH hinge region is limited to a single nucleotide substitution, which causes a Met-Thr interchange at amino acid position 9 (IMGT hinge numbering). We have analysed the diversity at this region more in-depth by, (1) analysing the allelic variation in 11 breeds of domestic European rabbit (Oryctolagus cuniculus cuniculus), and (2) sequencing the gamma hinge exon in wild specimens of six species of rabbit (Oryctolagus and Sylvilagus) and hares (Lepus), including the two Oryctolagus subspecies (O. cuniculus cuniculus and O. cuniculus algirus). It appeared that among leporid species, amino acid changes occur exclusively at positions 8 and 9. However, while position 8 is occupied by either Pro or Ser residues, four different residues can occur at position 9 (Met, Thr, Pro and Leu). This variation concerns sites of potential O-glycosylation and/or proteolytic cleavage, suggesting that the underlying genetic diversity could be the outcome of selection. Preservation of the gamma hinge polymorphism in domestic stocks could therefore be important. We report here a polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism protocol that has allowed the monitoring of the heterozygosity levels at the gamma hinge in 11 breeds of domestic European rabbit.     

Genetic characterization of the chemokine receptor CXCR4 gene in lagomorphs: comparison between the families Ochotonidae and Leporidae

Chemokines receptors are transmembrane proteins that bind chemokines. Chemokines and their receptors are known to play a crucial role in the immune system and in pathogen entry. There is evidence that myxoma virus, the causative agent of myxomatosis, can use the chemokine receptor CXCR4 to infect cells. This virus causes a benign disease in its natural host, Sylvilagus, but in the European rabbit (Oryctolagus cuniculus) it causes a highly fatal and infectious disease known as myxomatosis. We have characterized the chemokine receptor CXCR4 gene in five genera of the order Lagomorpha, Ochotona (Ochotonidae), and Oryctolagus, Lepus, Bunolagus and Sylvilagus (Leporidae). In lagomorphs, the CXCR4 is highly conserved, with most of the protein diversity found at surface regions. Five amino acid replacements were observed, two in the intracellular loops, one in the transmembrane domain and two in the extracellular loops. Oryctolagus features unique amino acid changes at the intracellular domains, putting this genus apart of all other lagomorphs. Furthermore, in the 37 European rabbits analysed, which included healthy rabbits and rabbits with clinical symptoms of myxomatosis, 14 nucleotide substitutions were obtained but no amino acid differences were observed.     

Isolation and characterization of a new Vesivirus from rabbits

This report describes the isolation, cDNA cloning, complete genome nucleotide sequence, and partial characterization of a new cultivable calicivirus isolated from juvenile feeder European rabbits (Oryctolagus cuniculus) showing symptoms of diarrhea. Absence of neutralization by type-specific neutralizing antibodies for 40 caliciviruses and phylogenetic sequence comparisons of the open reading frame 1-encoded polyprotein with those of other caliciviruses demonstrate that this new calicivirus is a putative novel member of the Vesivirus genus which is closely related to the marine calicivirus subgroup. According to its putative classification, this new virus has been named rabbit vesivirus.     

中国狂犬病毒疫苗株（5aG株）糖蛋白基因的克隆与序列分析

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法从中国狂犬疫苗株（５ａＧ株）病毒感染细胞中扩增得到该株病毒糖蛋白基因，并进行序列测定。结果表明该基因开放阅读框架全长１５７５ｂｐ，编码５０５个氨基酸的成熟糖蛋白及Ｎ－端１９个氨基酸的信号肽，该基因与其他株系相应基因比较，核酸序列同源性为８８％～９１％，氨基酸序列同源性为８７％～９０％，其中膜外区同源性高于膜内区及跨膜区同源性。糖蛋白中重要功能区段嗜乙酰胆碱受体区段、抗原位点３等在个株系间高度保守。     

酵母双杂合系统BD端血型糖蛋白A 表达质粒的构建

目的:获得血型糖蛋白A(GPA)cDNA片段,并构建酵母双杂合BD端表达质粒。方法:利用RT-PCR方法,从K562细胞mRNA中扩增GPAcDNA片段,约410bp。测序后将其克隆至pbridge载体上。用醋酸锂法将构建好的pbridge-GPA转染酵母菌AH109,观察其在选择性培养基上的表达情况。结果:克隆到的410bpGPAcDNA编码的氨基酸序列基本与公布序列相同。pbridge—GPA转染酵母菌后,在SD/Gal/—His/Ura培养基上出现1mm大小白色菌落。结论:获得了血型糖蛋白AcDNA克隆,pbridge—GPA对酵母无毒性,不能激活检测基因,可作为酵母双杂合系统中的靶基因。