miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

 目的：探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor 和miR-126 mimics 进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用 real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞 VEGF  mRNA 和蛋白水平的表达。结果：转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor 使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调（P<001）;转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 mimics 使EA.hy926细胞的VEGF 在mRNA及蛋白水平显著下调（P<001）。结论：miR-126 能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。     

丹参酮IIA通过抑制p38 MAPK通路减轻PM2.5对血管内皮细胞的损伤

 目的: 探讨PM2.5对EA.hy926型人脐静脉内皮细胞损伤的影响及丹参酮ⅡA在这一过程中的作用及机制。方法: 采集广州城区大气PM2.5并以不同质量浓度(0、20、200、400 mg/L)染毒EA.hy926细胞24 h,MTT法测细胞存活率,流式细胞术测细胞凋亡,Western blot法测p-p38 MAPK、Bax和Bcl-2的蛋白水平,ELISA法测白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,并测定细胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脱氢酶(LDH)活性;分别加入丹参酮ⅡA(5、10、20μ mol/L)和p38 MAPK通路特异性阻滞剂SB20358020μ mol/L检测丹参酮ⅡA的干预作用及机制。结果: 与对照组比较,PM2.5染毒后呈剂量依赖性降低EA.hy926细胞的存活率,上调p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以促进细胞凋亡,诱导分泌IL-6及TNF-α,降低SOD活性,增加MDA含量及LDH活性,差异均有统计学显著性(P<0.05);丹参酮ⅡA呈剂量依赖性增加EA.hy926细胞的存活率,下调p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2蛋白比率以抑制细胞凋亡,降低IL-6及TNF-α含量,增加SOD活性,降低MDA含量及LDH活性,差异均有统计学显著性(P<0.05)。结论: 丹参酮ⅡA可通过抑制p38 MAPK通路,减轻PM2.5对EA.hy926细胞的损伤。     

红葱头提取物减轻PM2.5诱导的血管内皮细胞的氧化应激

目的探究红葱头提取物对PM2.5诱导的血管内皮细胞EA.hy926的保护作用的研究。方法实验分为空白对照组、PM2.5组、阳性对照组(N-乙酰半胱氨酸+PM2.5组)和红葱头提取物+PM2.5组,PM2.5配制成30μg/mL,NAC浓度为10 mmol/L,红葱头提取物的浓度为64μg/mL。通过CCK-8法检测计算细胞存活率;ROS试剂盒检测细胞损伤产生的自由基;WB检测相关凋亡分子(Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9)的表达。结果 CCK-8结果显示:PM2.5会使EA.hy926细胞存活率明显下降,但红葱头提取物预处理后能提高PM2.5损伤的细胞存活率;细胞内产生的活性氧量由小至大为:空白对照组阳性对照组红葱头提取物+PM2.5组PM2.5组;WB分析样本相关凋亡蛋白表达:与对照组相比,PM2.5染毒后,EA.hy926细胞内促凋亡蛋白Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9表达上调,用红葱头提取物预处理可以下调PM2.5诱导的Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9的表达。结论红葱头提取物对PM2.5引起的血管内皮细胞的氧化应激具有保护作用。     

ZNF580在1-磷酸鞘氨醇诱导内皮细胞迁移和增殖中的作用

 目的：研究人锌指蛋白ZNF580在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)诱导内皮细胞迁移和增殖中的作用,为探讨ZNF580功能提供科学依据。方法：RT-PCR检测S1P受体在EA.hy926细胞的表达情况;不同浓度(0~10 μmol/L) S1P刺激EA.hy926细胞不同时间(0~12 h)后,RT-PCR和Western blotting检测S1P对ZNF580表达的影响;利用p38 MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580研究S1P是否通过此信号通路影响ZNF580的表达;脂质体转染法获得瞬时过表达和瞬时低表达ZNF580的EA.hy926细胞;Transwell实验及MTT比色法分析ZNF580对内皮细胞迁移和增殖活性的影响。结果：EA.hy926细胞表达S1P1、S1P3和S1P5三种受体,其cDNA的特异性扩增产物分别为352 bp、701 bp和236 bp;S1P刺激EA.hy926细胞后,ZNF580的表达呈现剂量和时间依赖性增高;SB203580能够抑制S1P诱导的ZNF580的上调作用;ZNF580过表达（低表达）后内皮细胞迁移和增殖活性明显增强（减弱）。结论：S1P通过p38 MAPK信号通路影响ZNF580的表达;ZNF580在内皮细胞迁移和增殖过程中起着重要的调控作用。     

PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及机制

目的:从大气细颗粒物PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响,研究PM2.5对血管内皮细胞的毒性。方法:体外培养血管内皮细胞株EA.hy926,用不同浓度的PM2.5染毒24 h后,用CCK-8法测细胞的活性,用DCFH-DA荧光标记法检测细胞内氧自由基生成情况,用流式细胞术检测细胞凋亡率,然后用Western blot法检测凋亡相关蛋白细胞色素C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达变化。结果:CCK-8法结果显示PM2.5对血管内皮细胞有明显的毒性,在浓度大于25 mg/L时可使EA.hy926细胞活性显著下降;PM2.5染毒24 h后可见DCFH-DA荧光染色增强,说明细胞内有大量的氧自由基形成;流式细胞术和Western blot检测证实PM2.5可以通过上调细胞色素C表达和活化cleaved caspase-9和cleaved caspase-3而诱导EA.hy926细胞凋亡。此外,用N-乙酰半胱氨酸抑制氧自由基生成可以抑制血管内皮细胞凋亡,提示PM2.5引起的细胞凋亡与氧化应激有关。结论:PM2.5可导致血管内皮细胞氧化应激水平增强和凋亡增加,这可能是其影响心血管系统功能的机制之一。     

肝X受体对血管内皮细胞EA.hy926内皮素1表达的调节作用

目的 研究肝X受体(liver X receptor,LXR)对血管内皮细胞珠EA.hy926中内皮素1(endo-thelin-1,ET-1)表达的影响,并初步探讨LXR调节ET-1表达的分子机制.方法 在培养的EA.hy926中加入LXR的特异性配体GW3965,作用28 h后收集细胞及培养上清液.细胞经Trizol法提取总RNA,以RT-PCR检测ET-1 mRNA水平的变化,以放射免疫法测定细胞上清液ET-1含量的变化;将克隆有ET-1启动子区的荧光素酶报告基因质粒phET1-Luc(克隆于pGL3-Basic)、pCMX-LXRα、pCMX-RXRα和内参照质粒psv-β-gal共同转染于EA.hy926细胞,经荧光素酶报告基因检测研究LXR对ET-1启动子活性的影响,从而初步了解LXR调节血管内皮细胞ET-1表达的分子机制.结果 LXR特异性配体GW3965能够抑制血管内皮细胞EA.hy926中ET-1的mRNA和蛋白表达水平,并且抑制ET-1启动子的转录活性.结论 活化血管内皮细胞LXR可下调ET-1的表达,且该作用与LXR抑制ET-1基因启动子的活性有关.     

肝癌肿瘤微环境对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响

研究间接共培养条件下肝癌细胞培养基对血管内皮细胞增殖及血管生成能力的影响,初步探讨肿瘤微环境下血管新生的分子机制。体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,与肝癌细胞株HepG2条件培养基进行共培养;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测肝癌细胞条件培养基对血管内皮细胞增殖的影响;血管管腔形成实验检测血管内皮细胞的血管生成能力。Western blot测定肝癌细胞条件培养基对血管内皮EA.hy926细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1表达的影响。结果表明,EA.hy926细胞经HepG2条件培养基处理后,其增殖能力明显增加。接种于Matrigel胶的EA.hy926细胞经HepG2条件培养基刺激后,形成管腔数目增加,成血管能力明显增强;同时,其胞内VEGF及其受体Flk-1的表达呈时间依赖性上调。肿瘤微环境下肝癌细胞作用于血管内皮细胞,可促进血管内皮细胞的增殖并提高其血管生成能力。     

冠心病患者血浆循环miR-126的表达及其对血管内皮细胞的影响

目的: 检测血浆循环miR-126和miR-16在冠心病患者和健康人群血浆中的表达,进一步探讨miR-126对血管内皮细胞的影响。方法: (1)收集52例冠心病心肌梗死型患者和52例健康人群的血样标本,采用Trizol LS提取血浆中总RNA,检测血浆miR-126和miR-16的表达;(2)通过转染在人血管内皮细胞株EA.hy926中抑制miR-126的表达,转染30 h后检测血管内皮生长因子的表达。结果: (1)与健康人群相比,循环miR-126在冠心病患者中的表达显著下降(P<0.05);miR-16在两组间的表达无显著差异(P>0.05);(2)内皮细胞株EA.hy926中miR-126被抑制后,血管内皮生长因子的表达为对照组的2.08倍(P<0.05)。结论: 血浆循环miR-126在冠心病患者表达下降,血浆循环miR-16在人群中的表达较稳定;miR-126通过负性调节血管内皮生长因子的表达,对血管内皮细胞产生调节作用。     

丹参多酚酸盐对过氧化氢诱导人内皮细胞EA.hy926氧化应激损伤的保护作用及机制

目的:探讨丹参多酚酸盐(salvianolate)对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926氧化损伤的保护作用及机制。方法:体外培养EA.hy926细胞,随机分为:正常对照组、损伤组和抗损伤(丹参多酚酸盐+过氧化氢)组。采用CCK-8法检测细胞活性,Transwell实验检测内皮细胞迁移能力;一氧化氮(nitric oxide,NO)试剂盒和ELISA法分别检测细胞培养液中NO和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平;流式细胞术检测细胞内超氧化物阴离子水平、线粒体跨膜电位和细胞凋亡情况;采用Western blot法检测caspase-3、cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax、NF-κB和p53蛋白表达水平。结果:与损伤组比较,不同剂量的丹参多酚酸盐预处理可提高EA.hy926细胞的活性、降低内皮细胞的凋亡,并促进细胞的迁移(P0.05);细胞上清液中VEGF和NO含量及细胞内线粒体膜电位水平显著升高(P0.05);细胞内ROS水平显著下降;NF-κB、p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平显著降低(P0.05);Bcl-2蛋白水平显著升高(P0.05)。结论:丹参多酚酸盐能减轻过氧化氢对EA.hy926细胞氧化应激的损伤作用,其机制可能与NF-κB通路的阻滞相关。     

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞NO合成的影响

目的:研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞NO合成的影响。方法:将体外培养的EA.hy926细胞分为正常对照组、软脂酸诱导的胰岛素抵抗细胞模型组、苦荞麦总黄酮组、二甲双胍组。采用硝酸盐还原酶法检测各组细胞上清液中NO含量,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western blot法检测各组细胞eNOS mRNA和蛋白的表达。结果:胰岛素抵抗细胞模型组细胞上清液NO含量,细胞eNOS mRNA及蛋白表达与正常对照组相比明显下降(P<0.05)。苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞上清液NO含量,细胞eNOS mRNA及蛋白表达与模型组相比,明显增多(P<0.05)。苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组相比,以上指标均无明显差异(P>0.05)。结论:苦荞麦总黄酮可有效促进软脂酸刺激下血管内皮细胞eNOS mRNA和蛋白的表达,从而增加NO的合成。     

克拉屈滨对人脐静脉内皮细胞活力和代谢的影响

目的:研究克拉屈滨对人脐静脉内皮细胞EA.hy926生长及分泌活性的影响,探讨克拉屈滨通过抑制内皮细胞活力发挥抗肿瘤的作用机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度(0.4~1μmol/L)克拉屈滨对内皮细胞活力的影响;用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测细胞凋亡和周期相关蛋白的表达水平;用ELISA法检测上清液肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平;Gries法检测上清液一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:克拉屈滨作用48 h对细胞活力有明显的抑制作用,其半数抑制浓度约为3.644μmol/L,随药物浓度升高和作用时间的延长而抑制作用增强。克拉屈滨作用48 h后,细胞周期被明显阻滞在S期,0.4μmol/L时S期细胞约43.74%,1μmol/L时S期细胞约77.23%。克拉屈滨处理后,各组内皮细胞的凋亡率没有显著差异。克拉屈滨处理后,caspase-3与Bax蛋白水平无明显差异;p21水平随着药物浓度增加而增高,而p53水平随着药物浓度增加而降低(P0.05)。克拉屈滨处理后,上清液中TGF-β1和TNF-α水平升高,VEGF含量减少(P0.05)。克拉屈滨处理后,上清液中NO含量减少(P0.05)。结论:克拉屈滨能明显抑制内皮细胞EA.hy926的活力,其主要机制与细胞周期阻滞有关。同时克拉屈滨能促进内皮细胞EA.hy926分泌TNF-α和TGF-β1,抑制其分泌VEGF和NO。     

梓醇抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞炎症反应及RAGE表达

目的:研究梓醇对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导的EA.hy926内皮细胞炎症反应的抑制作用并探讨其可能机制。方法:将常规培养的EA.hy926细胞随机分为对照组、梓醇对照组、AGEs组以及梓醇高剂量(0.5 mmol/L)、中剂量(0.25 mmol/L)和低剂量(0.05 mmol/L)保护组。激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧簇(ROS)的生成;RT-PCR和Western blot检测细胞中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)及晚期糖基化终产物受体(RAGE)的mRNA及蛋白的表达。结果:梓醇保护组ROS生成均明显减少,MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA及蛋白表达均显著降低,RAGE蛋白表达明显受抑制,且呈剂量依赖性(P0.05)。结论:梓醇能够有效抑制AGEs诱导的EA.hy926细胞内氧化应激,减轻炎症反应,其机制可能与其降低RAGE表达有关。     

RNA干扰内皮细胞分泌白细胞介素6影响平滑肌细胞的迁移

背景：血管支架置入后靶血管部位易发生炎症反应。 目的：利用siRNA技术抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,观察其对平滑肌细胞迁移的影响。 方法：采用RT-PCR测定脂多糖刺激EA.HY926细胞表达白细胞介素6 mRNA的时间梯度与浓度梯度,针对白细胞介素6构建短发卡状siRNA真核表达载体pGensil-1.1-白细胞介素6,通过lipofectamine 2000转染EA.HY926,抑制其白细胞介素6的产生。 结果与结论：pGensil-1.1-白细胞介素6转染EA.HY926细胞后,脂多糖刺激下EA.HY926细胞表达的白细胞介素6 mRNA及蛋白明显减少。共培养模型中,转染pGensil-1.1-白细胞介素6的EA.HY926细胞作用下,人脐静脉平滑肌细胞表达的基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白明显降低,结晶紫染色显示人脐静脉平滑肌细胞迁移数量减少。说明siRNA技术可抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,并通过降低平滑肌细胞基质金属蛋白酶9的表达减弱平滑肌细胞的迁移能力。     

磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B通路在缺氧血管内皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（PI3 K／Akt）通路在缺氧血管内皮细胞凋亡中的作用。方法（1）常规培养人血管内皮细胞株EA．hy926细胞,取部分人血管内皮细胞株EA．hy926按照随机数字表法分为两组：正常对照组：置于气体成分体积分数5％二氧化碳培养箱中常规培养;缺氧组：置于气体成分体积分数1％氧气、5％二氧化碳和94％氮气的三气培养箱中进行缺氧培养。采用蛋白质印迹法检测正常对照组内皮细胞和缺氧处理3、6、24 h的内皮细胞中Akt活化状态（以pAkt／Akt值表示）,流式细胞仪检测细胞凋亡率。（2）另取部分人血管内皮细胞株EA．hy926按照随机数字表法分为4组：正常对照组,缺氧组：培养方法同前,正常对照＋阻断剂组：用含50μmol／L的LY294002（PI3 K／Akt阻断剂）的培养液常规培养内皮细胞;缺氧＋阻断剂组：用含50μmol／L 的LY294002的培养液缺氧处理内皮细胞。均于培养3 h后收集内皮细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。对Akt活化状态与细胞凋亡率行单因素方差分析和LSD-t检验。结果（1）正常对照组细胞和缺氧处理3、6、24 h的内皮细胞pAkt／Akt值分别为0．67、0．79、0．34和0．35;正常内皮细胞和缺氧处理3、6、24 h 的内皮细胞凋亡率分别为（3．11±0．21）％、（4．57±0．85）％、（6．93±0．58）％、（9．96±2．62）％,组间比较差异有统计学意义（F＝8．96,P＝0．030）。与正常对照组细胞比较,缺氧处理3、6 h的内皮细胞凋亡率升高,差异无统计学意义（t＝1．03、2．70,P＝0．360、0．054）;缺氧处理24 h的内皮细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义（t＝4．99,P＝0．008）。（2）正常对照组、正常对照＋阻断剂组、缺氧组、缺氧＋阻断剂组培养3 h后细胞凋亡率为（2．39±0．50）％、（5．77±1．21）％、（3．76±1．05）％     

SPP对人脐静脉内皮EA.hy926细胞表达粘附分子的作用

目的:通过研究在N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)作用下,人脐静脉内皮EA.hy926细胞株(EA株)表达粘附分子CD54(ICAM-1)和CD62p(PS)的变化,探讨第二信使1-磷酸鞘氨醇(SPP)参与动脉粥样硬化(AS)粘附过程的机制。方法:采用流式细胞仪分群作用衡量EA细胞株和单核细胞之间的粘附率,用细胞免疫组化法检测DMS作用于EA株后引起的粘附分子的表达。结果:随着DMS作用剂量或作用时间的增加,CD54与CD62p的表达均减少,同时粘附率也相应地下降。结论:AS早期的粘附过程可能是通过SPP来转导信息,以促进粘附分子表达。     

TNF-α对小鼠脑微血管内皮细胞RhoA活性的影响

目的: 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对小鼠脑微血管内皮细胞RhoA活性和表达的影响,探讨p115RhoGEF是否参与其调控。方法: 以小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3为实验对象,TNF-α(10 μg/L)刺激后pull-down检测RhoA活性,Western blotting检测RhoA总蛋白表达;再将bEnd.3分为siRNA组(转染p115RhoGEF siRNA)和对照组(转染无活性的nsRNA),Western blotting检测p115RhoGEF蛋白的表达,pull-down检测TNF-α预处理后RhoA活性的变化。结果: RhoA活性在TNF-α刺激30 min后明显增高达到高峰,RhoA总蛋白表达在TNF-α刺激12 h和24 h显著上调;TNF-α刺激siRNA组bEnd.3细胞30 min后,RhoA活性较对照组明显降低。结论: TNF-α可导致小鼠脑微血管内皮细胞RhoA活性增加和表达上调,p115RhoGEF可能参与了TNF-α诱导RhoA活化的调控过程。     

Regulation of endothelial adhesion molecules by ligands binding to the scavenger receptor.

Monocyte adherence to the endothelium, their penetration to the subendothelial space and excessive lipid accumulation (foam cell formation) are the initial events in atherogenesis. Scavenger receptors have been reported to play an important role in foam cell formation, since modified low density lipoproteins can be taken up via scavenger receptors in a non-down-regulated fashion. In this study we demonstrate that stimulation of scavenger receptors in endothelial cells induces the expression of endothelial adhesion molecules. Polyinosinic acid (poly I), a known scavenger receptor ligand, significantly induced the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and E-selectin on human umbilical vein endothelial cells when compared with polycytidylic acid (poly C), a structurally related compound to poly I, which does not bind to the scavenger receptor. The effect of scavenger receptor ligands on the endothelial cell line EA hy. 926 was also tested. Poly I up-regulated ICAM-1 expression also on EA hy. 926 cells, while it had no effect on IL-1 beta or tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) production on the same cell line. Poly I-induced ICAM-1 expression on EA hy. 926 cells could be inhibited by H7, a protein kinase C inhibitor, while HA 1004, a preferential protein kinase A inhibitor, had no effect on ICAM-1 expression. The role of protein kinase C in scavenger receptor-mediated adhesion molecule upregulation was confirmed by the ability of poly I to directly activate protein kinase C, when measured with 3H-phorbol dibutyrate binding to EA hy. 926 cells, while poly C again was ineffective.