大鼠血管平滑肌细胞的贴块法培养

目的:探讨大鼠血管平滑肌细胞的原代培养方法与生长特性,为中药研究提供实验材料。方法:采用组织贴块法培养,倒置显微镜观察形态,电镜鉴定,台盼蓝染色活力检测。结果:倒置显微镜和电镜观察培养的血管平滑肌细胞生长状态良好,呈现平滑肌细胞特征性的“峰—谷”状结构,台盼蓝染色约有95%以上的细胞为活细胞。结论:本培养方法简单、经济,经过一定时间的操作训练,即可成功培养出平滑肌细胞。     

消化法培养大鼠脑血管平滑肌细胞

目的建立大鼠基底动脉平滑肌细胞培养的方法。方法取大鼠基底动脉,剪成约0.2mm的小段,用含胶原酶Ⅱ型(0.5g.L-1)、弹性酶(0.15g.L-1)、透明质酸酶Ⅳ-S型(0.5g.L-1)及脱氧核糖核酸酶Ⅰ型(0.1g.L-1)的消化液在37℃消化1h。而后用含20%FCS的DMEM/F12进行培养。结果原代培养3d后细胞可少量贴壁,1wk左右可传代,细胞传代成活率达97%。光镜和免疫细胞化学染色检测第4代细胞纯度为98%。结论与目前国内培养脑血管平滑肌细胞的方法相比,本方法操作简单,培养周期短,细胞纯度高。     

酶消化法分离培养糖尿病大鼠结肠平滑肌细胞

目的探讨糖尿病(DM)大鼠结肠平滑肌细胞(SMC)的培养方法。方法建立DM大鼠模型,分离结肠,用酶消化法体外培养正常及DM大鼠结肠SMC,α-肌动蛋白免疫荧光鉴定。结果造模后大鼠体重(165±16.8)g,较正常组(286±14.5)g明显减轻(P<0.01);血糖(25.4±3.4)mmol/L,明显高于正常组(4.3±0.8)mmol/L(P<0.01)。正常结肠SMC培养7 d左右即可融合成片、相互交叉成多层,进行传代;DM大鼠结肠SMC需12～14 d融合成片,进行传代;传代后正常结肠SMC需3～4 d即可进行下一次传代,而糖尿病结肠SMC则需5 d。α-肌动蛋白免疫组化染色鉴定均为SMC。结论 DM大鼠结肠SMC增殖速度比正常SMC慢,培养条件也较正常SMC更严格,形态学上与正常SMC相似。     

平滑肌细胞的培养及应用

细胞或组织培养泛指所有体外培养，是指在无菌条件下，从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。目前细胞或组织培养技术已广泛应用于生物学和医学各个领域，成为重要的基础科学之一。平滑肌细胞作为构成人体管道组织和空腔脏器的重要成分，其细胞培养对临床和基础研究有着极其重要的意义。现就平滑肌细胞培养技术及其应用作一综述。     

胆固醇脂质体对兔肾盂输尿管交界处平滑肌细胞的损害作用

为探讨胆固醇脂质体ｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌｌｉｐｏｓｏｍｅ,对兔肾盂输尿管交界处平滑肌细胞的损伤作用,分离幼兔肾盂输尿管交界处平滑肌,采用复合酶消化法行原代培养,人工制作胆固醇胆固醇脂质体,按不同浓度作用细胞后行显微镜、原位包埋电镜观察,电镜示经胆固醇脂质体作用后的平滑肌细胞部分细胞器肿胀、扩张、微丝有明显分开、减少趋势、提示胆固醇可引起平滑肌细胞膜、细胞器的损害     

二十二碳六稀酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞BKCa单通道的作用

目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)大电导钙激活性钾通道(BKca)的影响.方法 采用酶消化法获得大鼠CASMCs,用膜片钳技术以单通道内膜向外模式记录在跨膜电位60 mV下,加入0、10、20、30、40、50、60、70和80μmol/L DHA后,大鼠CASNXs的BKca单通道开放概率(Po)、电流幅度值(Am)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)的变化.结果 在跨膜电位60mV时,当DHA浓度＞10/μmol/L时,BKca通道的Po增大,且呈浓度依赖性,Po从(0.072±0.003)(0 μmol/L DHA,n=6)增至(0.606±0.089)(80μmol/L DHA,μ=10)(P＜0.05),EC50是(36.11±0.08)μmol/L,当DHA浓度＜10μmol/L时,Po增加不明显;加入不同浓度的DHA时,对通道Am及To的作用不明显,通道Tc明显缩短,Tc由(492.91±42.12)ms(0μmol/L DHA,n=6)缩短至(72.39±6.97)ms(80μmol/L DHA,n=10)(P＜0.05).结论 DHA能直接激活BKca通道而产生舒张血管、增加血流量的效应.     

大鼠腹主动脉平滑肌细胞培养及鉴定

目的 培养、鉴定大鼠腹主动脉平滑肌细胞.方法 采用组织贴块法分离培养大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,相差显微镜及即用型SABC免疫组化染色试剂盒进行细胞鉴定.结果 平滑肌细胞呈梭形或长梭形生长,透射电镜可见细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝和与之相连的致密体.高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤...     

鼠结肠平滑肌细胞的分离、培养与鉴定

目的建立体外培养鼠结肠平滑肌细胞的方法。方法应用酶解法分离大鼠的结肠平滑肌细胞,用含10％胎牛血清的DMEM液进行鼠结肠平滑肌细胞的原代培养及传代,并以免疫细胞化学对其进行鉴定。结果新鲜分离的结肠平滑肌细胞呈梭形,核居中。培养24h后细胞开始贴壁,3～5d后开始增殖,14d后细胞密集,呈峰谷样生长。细胞经平滑肌特异性肌动蛋白a-actin鉴定,确定为平滑肌细胞。结论应用酶解法可得到急性分离的鼠结肠平滑肌细胞,用含10％胎牛血清的DMEM液重悬分离得到的结肠平滑肌细胞,经过10d左右的培养可以获得结肠平滑肌细胞。该方法重复性好,效果稳定。     

家兔动脉血管平滑肌细胞培养方法的改进

目的提高家兔血管平滑肌细胞(vascular smooth mus-cle cell,VSMC)体外培养的成功率。方法以传统的主动脉平滑肌细胞培养方法中的组织块贴壁法为基础,从动物选择、培养基配制、血管取材、组织块的大小和接种间距、培养液的量及换液量、细胞传代的时机等多个重要环节进行改进;用倒置显微镜、电镜对培养细胞进行形态学观察,并用平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体免疫组织化学方法进行鉴定。结果台盼蓝检查传代细胞的存活率大于97%;光镜下见培养细胞平行排列呈长梭形及"峰、谷"样结构特征;免疫组织化学染色鉴定培养细胞中VSMC的纯度为97%;电镜技术观察到VSMC完整的超微结构。结论此培养方法能提高动脉平滑肌细胞原代培养的成功率,传代后血管平滑肌细胞生物学特征的稳定性好,可作为研究血管平滑肌细胞生物学行为的有效模型。     

高血压患者动脉平滑肌细胞培养的探讨

目的对高血压患者动脉平滑肌细胞培养方法进行探讨。方法运用植块贴壁法对高血压患者动脉平滑肌细胞进行体外培养,并用倒置显微镜进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定。结果运用植块贴壁法成功培养了高血压患者动脉平滑肌细胞,培养的细胞呈典型“峰谷”样生长,免疫组化S-P法检测α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(α-SMActin)表达,确认为人血管平滑肌细胞(hVSMC)。经传代培养至3～5代,细胞生长特性未见异常改变。结论植块贴壁法培养的高血压患者动脉平滑肌细胞生长稳定性好,且培养与纯化能同步进行。     

家兔主动脉平滑肌细胞原代培养的研究

目的探索高效快速的家兔血管平滑肌细胞体外原代培养技术,为分子生物学实验提供足量可靠的细胞来源。方法取家兔主动脉中层,用刀片切成约1mm3,采用不同浓度的Ⅰ型胶原酶以及不同消化时间对组织块进行预消化,然后将组织块贴在培养瓶上进行培养。结果1.5g.L-1胶原酶消化6h后组织块细胞迁出速度及组织迁出率明显提高(P<0.05),组织块贴壁后24h即可见血管平滑肌细胞从组织块周围游离出来,呈梭形或星形,d4～5即可进行传代培养,传代后d3～4即可融合成致密单层细胞,呈典型的峰谷交错状,经免疫组化SP法鉴定有α-actin的表达,进一步确认其为血管平滑肌细胞。结论经1.5g.L-1胶原酶消化6h后组织块细胞迁出速度且迁出率明显提高,从而大大缩短原代培养的时间。     

萘哌地尔抗大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

目的研究萘哌地尔(naftopidil,Naf)对去甲肾上腺素(noradrenalin,NA)诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响并探讨其机制。方法培养的VSMCs经NA诱导其增殖,分别用MTT比色法和细胞计数法检测Naf对VSMCs增殖的影响;荧光法测定细胞内钙浓度([Ca2+]i)及Real-TimeRT-PCR检测c-myc、c-fos、高血压相关基因(hypertension related gene-1,HRG-1)mRNA的表达。结果萘哌地尔(10-7～10-6mol·L-1)能够抑制NA诱导的VSMCs增殖,并明显降低VSMCs[Ca2+]i,降低c-myc、c-fos mRNA表达,增加HRG-1 mRNA的表达。结论萘哌地尔明显抑制NA诱导的VSMCs增殖,作用机制可能与其降低VSMCs[Ca2+]i、拮抗NA上调c-myc、c-fos mRNA的表达和拮抗NA下调HRG-1 mRNA的表达有关。     

大鼠脑基底动脉平滑肌细胞培养及功能鉴定

目的探讨大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的培养方法,了解生长特性。方法用组织贴块法培养大鼠脑基底动脉平滑肌,用免疫细胞化学法鉴定细胞,用RF-5000荧光分光光度计观察细胞内Ca2+浓度的动态变化来检测其活性。结果培养5d后可见组织块周围有平滑肌细胞长出,2wk后可融合传代,经平滑肌特异性肌动蛋白α-actin鉴定,确定为平滑肌细胞。钙离子通道激动剂可诱导细胞Fura-2荧光比值(F340/F380)上升,细胞活性良好。结论组织贴块法是大鼠脑基底动脉平滑肌细胞培养简单、高效、经济的实验方法,为脑血管疾病发病机制的研究提供了理想的细胞模型。     

雌激素对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 :观察雌激素对血管平滑肌细胞 (SMC)凋亡的影响。方法 :以大鼠为对象 ,观察正常对照组、去卵巢组及去卵巢 +雌二醇治疗组大鼠血管平滑肌细胞凋亡的关系。结果 :雌二醇治疗组血管平滑肌细胞凋亡较去卵巢组相比明显减少(P>0 .0 5 ) ,与正常对照组比较差别无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论 :雌二醇对血管平滑肌细胞的凋亡有抑制作用 ,可能是其预防动脉粥样硬化的机制     

粉防己碱对高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

探讨了粉防己碱 (Tet)抑制培养的大鼠主动脉平滑肌细胞 (AVSMC)增殖的作用 ,MTT法分析细胞增殖 ,[3 H]TdR参入法分析细胞DNA合成 .结果显示 :①肾血管性高血压〔RH ,二肾一夹 (2K1C)术后18周〕大鼠AVSMC超微结构呈典型的合成细胞特征 ;②RH大鼠AVSMC具有更活跃的增殖倾向 ,血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )和去甲肾上腺素 (NE)刺激下指数增长期细胞数和在NE刺激下的AVSMC生长率均明显增高 ;③Tet(50mg·kg- 1·d- 1,po ,2K1C术后 9周始 ,连续 9周 )治疗组的AVSMC对NE和AngⅡ诱导的细胞增殖反应性和生长率较RH组明显降低 ;④对RH组和伪手术组大鼠的AVSMC ,Tet(0 .1～ 10μmol·L- 1)体外给药可浓度依赖性地抑制NE或AngⅡ诱导的增殖和 [3 H]TdR参入 .研究表明 ,RH大鼠AVSMC对NE和AngⅡ促增殖作用敏感性及反应性增高 ;Tet可降低其对NE和AngⅡ的反应性 ,抑制AVSMC增殖和DNA合成 .     

Contribution of calcium dysregulation to impaired coronary artery contraction in Zucker diabetic fatty rats

Diabetic coronary artery injury is closely associated with Ca²⁺ dysregulation, although the underlying mechanism remains unclear. This study explored the role and mechanism of Ca²⁺ handling in coronary artery dysfunction in type 2 diabetic rats. Zucker diabetic fatty (ZDF) rats were used as the type 2 diabetes mellitus model. The contractility of coronary artery rings induced by KCl, CaCl₂, 5-HT and U46619 was significantly lower in ZDF rats than in Zucker lean rats. Vasoconstriction induced by 5-HT and U46619 was greatly inhibited by nifedipine. However, in the presence of 1 μM nifedipine or in the Ca²⁺-free KH solution containing 1 μM nifedipine, there was no difference in the vasoconstriction between Zucker lean and ZDF rats. Store-operated calcium channels (SOCs) were not involved in coronary vasoconstriction. The downregulation of contractile proteins and the upregulation of synthesized proteins were in coronary artery smooth muscle cells (CASMCs) from ZDF rats. Metformin reversed the reduction of vasoconstriction in ZDF rats. Taken together, L-type calcium channel is important for regulating the excitation–contraction coupling of VSMCs in coronary arteries, and dysregulation of this channel contributes to the decreased contractility of coronary arteries in T2DM.     

Oxidative stress and COX cause hyper-responsiveness in vascular smooth muscle of the femoral artery from diabetic rats

BACKGROUND AND PURPOSE: To investigate the dysfunction of vascular smooth muscle in streptozotocin-induced diabetic rats. EXPERIMENTAL APPROACH: Rings without endothelium of femoral arteries were suspended in organ chambers for isometric tension recording. The production of oxygen-derived free radicals was measured with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate using confocal microscopy. The protein expressions were measured by western blotting. KEY RESULTS: The concentration-response curves to U46619 and phenylephrine, but not that to KCl, were shifted to the left, suggesting a hypersensitivity of cell membrane receptors in diabetes. Exogenous oxygen-derived free radicals induced greater vasoconstrictions in the femoral artery from diabetic rats. Chronic treatment with apocynin (inhibitor of NADPH oxidase) and acute exposure to MnTMPyP (SOD/catalase mimetic) normalized the response. The catalase activity and the total glutathione level were reduced in arteries from streptozotocin-treated rats, confirming a redox abnormality. The basal oxidative state was higher in arteries from streptozotocin-treated rats and reduced in arteries from apocynin- and streptozotocin-treated rats, suggesting that the functional changes in diabetes are due to a chronic increase in oxidative stress. In the arteries of streptozotocin-treated rats, inhibitors of COX-1 and/or COX-2 prevented the hypersensitivity and reduced the increase in oxidative stress caused by phenylephrine and U46619, suggesting that both isoforms contribute to the smooth muscle dysfunction. The expression of proteins for COX-1 and COX-2 was increased in arteries of streptozotocin-treated rats and reduced in preparations of apocynin- and streptozotocin-treated rats. CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS: Chronic diabetes and the resulting increased oxidative stress activate the production of COX-derived vasoconstrictor prostanoids causing hypersensitivity of vascular smooth muscle.     

他汀类药物与血管平滑肌细胞凋亡

血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖和迁移在粥样斑块形成和冠状动脉介入治疗（PCI）后再狭窄中起非常重要的作用。他汀类药物不仅是一种有效的调脂药，同时还有多种调脂以外的作用。如他汀类药物可以抑制VSMC的增殖和迁移，并诱导其凋亡。临近病变部位的中层VSMC的凋亡可能造成斑块纤维帽容易破裂，进而引起斑块不稳定和临床事件。但研究证实他汀类药物有稳定斑块的作用，且新生内膜VSMC对他汀类药物诱导的凋亡作用比普通的血管中层VSMC更敏感。因此，他汀类药物的促新生内膜VSMC凋亡作用可能对预防PCI术后再狭窄起有益作用。具体作用机制以及临床上如何合理发挥此类作用尚待进一步研究。