pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。     

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的： 构建重组人HIF-lα 真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。 方法： 从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA 为模板,加入所设计的3对引物［EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物］所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。 结果：通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp　片段,与预想结果一致。结论：成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。     

靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体

目的探索利用PCR产物靶向克隆法构建能够表达凋亡素的pET15b-VP3原核表达载体。方法以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b,得到重组表达载体pET15b-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切,图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体。结果 PCR产物经过电泳鉴定可见366bp特征性的VP3片段,重组质粒经双酶切电泳获得了一个大小为366bp的VP3片段,重组质粒测序证实VP3cDNA编码区成功地插入了pET15b,且其序列与GeneBank中VP3cDNA序列完全一致。结论靶向克隆法可快速,高效地构建pET15b-VP3原核表达载体,为进一步研究VP3药用价值奠定了基础。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA的构建及鉴定

目的:构建人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA.方法:根据CyPA基因设计引物,从人肺痛组织eDNA中扩增目的基因.pET30α(+)质粒、目的基因DNA经Nde I酶、Xho I酶双酶切,用DNA快速连接试剂盒连接得重组子pET30α(+)-CyPA.将重组子转化DH5α,经卡那霉素琼脂糖平板筛选,挑选阳性克隆进行PCR扩增并测序.结果与结论:快速PCR能从阳性克隆中扩增出目的DNA.将重组质粒测序,由起始密码ATG到终止密码TAG止,扩增得到的目的基因片段具有完整的阅读框;与人CyPA基因cDNA序列进行比较,同源性达到99.8%.重组质粒pET30α(+)-CyPA构建成功.     

唾液富组蛋白5表达载体的构建

目的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoR I＋Sal I双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1，无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

粉尘螨Ⅱ类抗原(Der f 2)的cDNA克隆测序及亚克隆

目的 :获得粉尘螨Derf 2cDNA克隆及亚克隆 ,并进行测序。方法 :设计合成引物 ,从粉尘螨螨体中提取RNA ,经RT PCR获得cDNA ,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至 pMD 18T ,转化大肠杆菌E .coliJM 10 9,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序 ,将PCR筛检阳性重组子及 pET 3 2a( +)表达载体分别用SacⅠ和NotⅠ双酶切 ,连接转化至E .coliCompetentCellJM 10 9中过夜培养 ,挑选菌落进行酶切鉴定。结果 :从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf 2cDNA片段 ,成功构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚克隆 ,酶切产物的大小与预期相符。结论 :成功地对粉尘螨Derf 2cDNA进行体外扩增并构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚 克隆     

pSUPER-2H1重组双靶向干扰载体的构建及鉴定

目的构建含有双H1启动子的重组pSUPER-2H1质粒载体,为进一步构建同时干扰LRP和P—gp基因的RNAi载体做基础。方法以pSUPER质粒中原有的H1启动子为模板PCR扩增H1启动子,将扩增的H1启动子连接到Pumc-T载体上,重组的质粒载体命名为Pumc—T—H1。将pSUPER质粒与Pumc—T-H1利用xhoI和salⅠ进行双酶切,将两者的酶切产物连接后转化大肠杆菌DH5a,抽提后的重组质粒载体命名为pSUPER-2H1,并对其进行酶切鉴定和测序。结果经酶切鉴定及测序证实克隆入pSUPER质粒的H1启动子与pSUPER质粒中原有的H1启动子序列一致,从而成功构建了pSUPER-2H1重组质粒。结论pSUPER-2H1重组质粒的构建为下一步LRP和P—gP基因双干扰RNAi重组质粒的构建奠定了基础。     

组织型纤溶酶原激活物cDNA克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活物（t－ＰＡ）cＤＮＡ并构建含t－ＰＡ基因的腺病毒表达 载休划硫氰酸胍；－酚－氢仿一步法从Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞中提取总ＲＮＡ，并经反转录ＰＣＲ获得t－ＰＡcＤＮＡ。将质粒pＵＣ１９双酶切并纯化回收大片段，与纯化后的ＰＣＲ产物连接构成pＵＣ１９t－ＰＡ，转化大肠肝菌ＪＭ１０９，挑选白色克隆作酶切鉴定、测序，pＵＣ１９t－ＰＡ及腺病毒载体pＡdＭＶ（６．６７ｋｂ）分别双酶切前者回收１     

人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

~1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。