幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)DNA疫苗。方法 扩增全长napA(编码HP-NAP)，将其与克隆载体pBT连接，经测序及同源性分析后，将相应片段亚克隆入真核表达载体pIRES，经双酶切及PCR鉴定。结果 PCR扩增-435bp产物，核苷酸序列测定及BLAST分析表明，所克隆序列与基因库中Hp悉尼株(SS1)napA核苷酸及蛋白质的同源性均为98％。ANTHEPROT软件预测其蛋白质具有良好的疏水性和抗原性。经PCR及双酶切鉴定，证实成功构建携带，napA的重组真核表达质粒plRES-napA。结论 成功构建并鉴定了HP-NAP重组DNA疫苗，为进一步研究其免疫原性及研制口服DNA疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Hp neutrophil-activating protein,Hp-NAP)基因(napA)活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,初步观察其对慢性Hp感染的免疫保护作用.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并经同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌构建Hp-NAP口服DNA疫苗.口服Hp-SS1建立SS1长期感染小鼠模型,30周后随机均分为3组,每组各5只.治疗组予109cfu/0.4 ml疫苗菌灌胃,1次/周×3周;2个对照组分别予等体积生理盐水或空白质粒.末次免疫4周后行快速尿素酶检测,ELISA测定血清抗体效价.结果:重组真核表达质粒pIRES-napA成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207;所克隆napA与GenBank中SS1-na-pA核苷酸和蛋白质的同源性均＞98%.免疫后4周治疗组75%(3/4)小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性,差异显著(P＜0.05);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论:成功构建了具有较好免疫保护作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp核酸疫苗奠定了基础.     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的构建含幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（CagA）基因片段的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA。方法从幽门螺杆菌细胞株中扩增出CagA基因片段,经回收、纯化,连接到质粒pGEM-T上,测序、酶切后与质粒pEGFP-C3连接,脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823,用荧光显微镜观察转染的细胞。结果通过测序、酶切证明CagA插入质粒正确,构建出载体pEGFP-C3-CagA,转染后经荧光显微镜观察到胃癌细胞株BGC823中有绿色荧光。结论成功构建表达CagA的真核绿色荧光载体。     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌双基因多表位重组原核表达工程菌的构建及其表达特性的研究

目的构建含幽门螺杆菌尿素酶保守基因序列ureI和ureB的双基因（简称IB）多表位原核表达质粒以及原核表达T程菌,并研究其微生物学特性。方法通过生物信息学方法从ureI和ureB基凶中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成所选择的表位基因序列并构建原核重组表达质粒pET28a（＋）／IB。经限制性内切酶（EcoR I,XhoI）鉴定及DNA测序鉴定后,将重组质粒导人大肠杆菌BL21（DE3）。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（riB）的表达情况,用Westernblot检测riB的免疫反应性。结果构建的双基因多表位基因序列与所设计的一致;工程菌经IPTG诱导后做SDS-PAGE电泳显示,在28kD左右有一条明显蛋白条带,Westernblot结果显示在28kD左右出现特异反应条带。结论成功构建含ureI和ureB双基因序列的原核表达质粒pET28a（＋）／IB及工程菌,该工程菌表达的重组蛋白riB能被抗幽门螺杆菌悉尼株（H．pylori SSl）的特异抗体所识别,表明该新重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A真核表达载体的构建与表达

目的构建幽门螺旋杆菌（Helieobaeterpylori,Hp）细胞毒素相关蛋白A（cytotoxin—associatedprotein,CagA）基因表达载体并表达其编码蛋白。方法从胃黏膜活检标本中分离Hp,提取核酸,采用RT—PCR技术扩增CagA基因,将其克隆至pEGFP真核表达载体中,构建HpCagA基因真核表达载体并转染293-T细胞表达其编码蛋白。结果通过PCR、双酶切、测序鉴定证实CagA基因的真核表达载体构建成功,免疫印迹法证实CagA蛋白的表达。结论成功构建了HpCagA基因真核表达载体并表达其编码蛋白,为后期功能研究提供了材料和基础。     

HIV/AIDS临床各期患者胃粘膜幽门螺杆菌感染研究

目的 分析HIV/AIDS临床各期患者胃粘膜幽门螺杆菌(Hp)感染情况,探讨其发生的机制.方法 HIV/AIDS临 床各期患者170例,对照组为普通患者(HW阴性)34例,均行胃镜检查,并对活检粘膜行快速尿素酶及病理检测明确有无Hp感染.结果 各组Hp检出率分别为无症状HIV感染期(A1、A2)23.4%(11/47例),有症状感染期(B1、B2)14.0%(8/57例),AIDS期(A3、B3、C1-3)13.6%(9/66例),对照组47.1%(16/34).HIV/AIDS各组Hp检出率低于对照组,有症状感染期(B1、B2)组和AIDS期(A3、B3、C1-3)组均低于无症状HIV感染期(A1、A2)组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在HW/AIDS临床各期患者中,胃粘膜严重的免疫缺陷,可能导致Hp感染率下降.

Abstract：

Objective To analyze Helicobacter pylori infection in the gastric mucosa of patients with HIV/AIDS in difierent clinical stages.Methods This study involved 170 patients with HIV/AIDS and 34 HIV-negative patients.All the patients underwent upper endoscopy and antral gastric biopsy to determine the status of Helieobaeter pylori infection using aniline red staining and rapid urease test.The patients with HIV/AIDS were stratified based on CD4~+T lymphocyte counts and clinical setting into asymptomatic HIV infection(A1,A2)group,symptomatic HIV infection(B1,B2)group and AIDS(A3,B3,C1-3)group.Results The prevalence of Helicobacter pylori infection in HIV/AIDS patients was 16.5%(28/170),and in the 3 groups classified,the infection rates were 23.4%(11/47),14.0%(8/57),and 13.6%(9/66),respectively;the infection rate was 47.1%(16/34) in the control group.Helicobacter pylori infection rate in the gastric mucosa of the patients with HIV/AIDS in different clinical stages was significantly lower than that of the control group (P<0.05);the infection rates in symptomatic HIV-infected(B1,B2)group and AIDS(A3,B3,C1-3)group were significantly lower than that in asymptomatic HIV-infected (A1,A2)group(P<0.05).Conclusion The low Helicobacter priori infection rate in HIV/AIDS patients may result from severe immunodeficiency in the gastric mucosa.     

幽门螺杆菌基因型与慢性胃炎和消化性溃疡的相关性

目的 探讨Hp基因型与慢性胃炎、消化性溃疡的关系。方法 对标准株和临床分离株幽门螺杆菌空泡毒素基因vacA和致病岛基因的cagA、cagE、cagT片段进行PCR扩增，对基因组DNA进行随机扩增多态性分析（RAPD），并以Hela细胞测定全部菌株的VacA毒素活性。SPSS13．0软件聚类分析进行基因分型。结果 全部菌株被分为3个型别，慢性胃炎、消化性溃疡和非胃炎非溃疡分别有自己的优势基因型，且各型之间的总体分布差异具有统计学意义。结论 Hp基因型与疾病类型有关，空泡毒素基因和致病岛基因可作为Hp基因分型的靶基因，RAPD是有效的基因分型手段。     

幽门螺杆菌对胃癌上皮细胞株AGS细胞的生长抑制作用及其分子机理探讨

目的 观察体外实验中幽门螺杆菌(Hp)对胃癌上皮细胞株AGS细胞生长的影响,探讨Hp致病的分子机理。方法 胃癌细胞系AGS细胞体外培养,加入Hp活菌后,通过形态观察、细胞计数了解细胞生长情况;通过细胞核荧光染色、细胞DNA电泳检测细胞凋亡;通过流式细胞技术观察Hp对AGS细胞周期的影响,并进一步检测相应的细胞周期素。结果 Hp对AGS细胞生长有抑制作用。加入Hp后细胞凋亡增加,并导致G1／S细胞周期阻滞,伴有细胞周期素D1表达上调。结论 Hp急性感染可抑制AGS细胞生长,此作用可能与其诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞有关。提示Hp感染能够破坏正常细胞周期调节。     

肠道致病大肠埃希菌流行病学和分子机制的研究进展

肠道大肠埃希菌既是人类正常菌群又是造成全世界发病和死亡的重要病原体。肠道致病大肠埃希菌传统上分为6种：肠道致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠道出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠道侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠道聚集性大肠埃希菌（EAEC）、肠道产毒素性大肠杆（ETEC）和弥漫黏附大肠埃希菌（DAEC）。本文中提出肠道致病型大肠埃希菌分为8种,还包括2种新的致病型大肠埃希菌——黏附浸润性大肠埃希菌（AIEC）和产志贺毒素的聚集性大肠埃希菌（STEAEC）。在人类宿主细胞中,通过检测肠道大肠埃希菌移植和研究疾病的分子机制．发现肠道致病型大肠埃希菌根据Ⅲ型分泌系统（T3SS）,可分为依赖T3SS致病型（EHEC、EPEC、EIEC）和非依赖T3SS致病型（ETEC、EAEC、STEAEC、DAEC、AIEC）2大类。本文主要介绍了肠道致病大肠埃希菌的流行病学和分子机制的研究进展。     

miRNA调控树突状细胞成熟机制研究进展

微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子,主要通过抑制其靶基因而起到调控作用,在人体发育、细胞增殖、凋亡、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥着重要作用。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强的抗原呈递细胞,并且不同成熟状态的DC对T细胞免疫有双向调节的作用。DC的成熟过程也受到miRNA的调控。现就近年来关于miRNA参与调节DC成熟相关信号机制的研究进展予以综述。     

CagA基因阳性Hp培养滤液对人胃粘膜上皮细胞系DNA损伤作用

目的 研究 CagA阳性幽门螺杆菌（Hp）培养滤液对人胃粘膜上皮细胞（GES－1）DNA的损伤作用。方法 制备Hp培养滤液,PCR鉴定CagA基因。采用单细胞微凝胶电泳观察Hp（CagA＋）培养滤液对GES－1细胞DNA的损伤作用。结果 Hp（CagA＋）培养滤流可使GES－1细胞形成彗星现象。结论 Hp（CagA＋）培养滤液可以导致GES－1细胞的DNA损伤。DNA损伤可能是CagA诱导GES－1细胞恶性转化的机制之一。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因在减毒鼠伤寒杆菌中的表达

目的：制备能表达幽门螺杆菌（Ｈｐ）尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的减毒鼠伤寒杆菌,初步确定是其否可用作抗ＨＰ的口服疫苗。方法应用ＰＣＲ扩增ＨＰＵｒｅＢ基因片段,测序后克隆入原核表达载体ＰＴｃ０１,转化ＬＢ５０００修饰后再转化ＳＬ３２６１,得到重组的减毒鼠伤寒杆菌ＳＬ３２６１／ＰＴｃ０１－ＵｒｅＢ。应用抗ＨＰ菌体蛋白兔血清行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＵｒｅＢ在ＳＬ３２６１中的表达,ＳＬ３２６１／ＰＴｃ     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌感染及根除后胃黏膜CD4＋CD25＋调节性T细胞表达的变化

目的观察幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）感染及根除后CD4＋CD25＋调节性T细胞的表达变化,以探讨Hp长期定植在胃黏膜引起慢性持续性感染的原因。方法采用免疫组化法分析45例Hp阳性患者（研究组）Hp清除前后及35例Hp阴性患者（对照组）胃黏膜中的CD4＋CD25＋调节性T细胞的表达变化。结果Hp阳性患者局部胃黏膜中的CD4＋CD25＋调节性T细胞明显增多,占5．012％,明显高于Hp阴性患者胃黏膜中的CD4＋CD25＋调节性T细胞,占0．739％,差异有统计学意义（P〈0．01）.根除Hp治疗后CD4＋CD25＋调节性T细胞明显减少,占0．551％,明显低于清除前,差异有统计学意义（P〈0．01o结论Hp感染后可能通过上调CD4＋CD25＋调节性T细胞的表达,抑制Hp引起的特异性T细胞反应,造成Hp的长期定植。根除Hp后人胃黏膜内CD4＋CD25＋调节性T细胞明显减少可能是Hp被清除后,该类细胞凋亡或者移出胃黏膜所致。     

pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。