蝎毒素调控离子通道的研究新进展

近年来,随着蝎毒素理化性质及结构功能逐渐被认知,其在多种离子通道(Na^ 通道、K^ 通道、Cl^-通道、Ca^2通道等)的生物学功能,已引起科学工作者的极大兴趣。而离子通道与肌肉收缩、神经分泌,体内电解质的平衡,动作电位的频率与延续以及静息电位等一系列细胞活动密切相关。本文对蝎毒多肽对离子通道作用的研究进展进行综述。     

蝎毒多肽提取物对肿瘤生长和细胞免疫功能的影响

目的：观察蝎毒多肽提取物（PESV）对大鼠W256癌肉瘤抑制作用及其对荷瘤大鼠细胞免疫功能的影响。方法：将30只Wistar荷瘤大鼠,随机分为模型组、5-FU治疗组和蝎毒治疗组,连续灌胃给蝎毒多肽提取物7d,处死,计算各组抑瘤率;流式细胞术（FCM）检测外周血T淋巴细胞亚群变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清中细胞因子INF-γ和IL-4含量。结果：蝎毒治疗组抑瘤率为55.21%。与模型组相比较,蝎毒治疗组荷瘤大鼠外周血中CD4+T细胞比例明显提高,CD8+T细胞明显降低,CD4+T/CD8+T值明显增高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;血清中细胞因子INF-γ含量明显升高,而IL-4含量显著降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论：蝎毒多肽提取物对W256荷瘤大鼠肿瘤有明显抑制作用,通过提高细胞免疫功能,逆转荷瘤机体Th1/Th2漂移,改变荷瘤机体免疫抑制状态,发挥抗肿瘤作用。     

蝎毒素ITX氨基酸含量及蛋白质组分分析

目的:测定蝎毒素ITX样品中17种氨基酸的含量,分析并鉴定其中某些蛋白质组成成分.方法:将常压柱分离得到的蝎毒素蛋白ITX利用L-8800氨基酸分析仪进行氨基酸含量分析;以17 cm pH 3～10固相pH梯度胶条(IPG)为第一向IEF,18%SDS聚丙烯酰胺凝胶为第二向进行双向电泳;PDQuest 7.1.1分析软件分析电泳图谱,筛选目的蛋白,然后对重现性和稳定性良好的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-Ms)和串联质谱(MS/MS)分析,得到肽质量指纹图谱(PMF)数据,登录网站http://www.matrixscience.com.用Mas-cot程序检索NCBInr数据库,鉴定蛋白质.结果:ITX 17种氨基酸的含量从0.14%-11.35%不等;从蝎毒素ITX蛋白样品中共筛选出9个等电点不同,相对分子质量约为5800的蛋白点,其中蛋白点1、2、3、4位于酸性区,蛋白点5、6、7、8、9位于碱性区.获得了4、6号蛋白点多肽的PMF数据.结论:测定了蝎毒素ITX蛋白的氨基酸含量;建立蝎毒素ITX蛋白质组学研究方法,为后续工作奠定了基础.     

蝎毒素BmK M2的分离鉴定及其电生理活性研究

从东亚钳蝎蝎毒中分离鉴定出新型的Na⁺通道毒素,采用Sephadex-G-50分子筛、高效液相色谱、多肽指纹图谱及氨基酸测序等技术从野生东亚钳蝎毒液中分离鉴定了一种长链多肽毒素BmK M2,其相对分子质量为7 235.5,由64个氨基酸组成,包含4对二硫键。序列比对显示,BmK M2的序列与已发现的Na⁺通道毒素BmK M1、BmK M3、BmK M9等具有较高的序列和结构相似性,是一种潜在的新型Na⁺通道调节剂。全细胞膜片钳实验结果显示,BmK M2可显著增强电压门控Na⁺通道Nav1.7的激活,延迟Nav1.7的稳态失活及关闭状态失活,但对Nav1.8无活性。实验结果表明BmK M2可作为一种新型的Na⁺通道探针,用于Nav1.7结构功能研究以及靶向药物的开发。     

蝎皮蛋白质组分对正常小鼠免疫功能的影响

目的研究蝎皮蛋白质组分对正常小鼠免疫功能的影响,为蝎皮开发利用和发现新的活性物质提供实验依据。方法采用刃天青和M TT法检测蝎皮水溶性总蛋白(STP)、总角蛋白(STKP)及水溶性蛋白组分Ⅱ(STPⅡ)对正常小鼠T、B淋巴细胞转化、NK细胞杀伤活性的作用。结果STP和STKP ig给药后,小鼠脾T淋巴细胞增殖反应高于正常对照组,但只有STP小剂量组与对照组比较差异显著(P<0.001)。B淋巴细胞增殖反应结果显示STKP大、小剂量均可加强增殖反应,与对照组比较差异极显著(P<0.05、0.01)。STP和STKP大、小剂量组NK细胞杀伤活性与对照组相比有升高趋势。STPⅡ两个剂量组100、200 m g/kg ig给药均能明显抑制正常小鼠T、B淋巴细胞增殖反应,与对照组相比差异极显著。STPⅡ大剂量组NK细胞杀伤活性与对照组相比有降低趋势,但无统计学意义。结论STP和STKP具有一定的提高免疫功能的作用,STPⅡ则具有抑制免疫功能的活性。揭示蝎皮蛋白质组分具有免疫调节药理活性,值得深入研究。     

红参须根中多肽成分的分离与鉴定

用反相高效液相色谱技术从红参须根中分得一个新的多肽化合物。根据氨基酸组成分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效排阻层析分子量测定结果，鉴定为33肽。文中还报道应用组织培养技术和免疫手段．研究了红参须根多肽的活性，并与人参皂甙的活性进行了对比。     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

鞣花酸对脾淋巴细胞增殖、自然杀伤细胞活性和 Th1/Th2 细胞因子的影响

目的 通过鞣花酸对免疫细胞和细胞因子的定量化实验,筛选新的免疫调节制剂。方法 实验小鼠 ig 鞣花酸 (2、10、50 mg/kg) 10 d,测定体质量变化、脾脏指数,采用酶标法观察鞣花酸对脾淋巴细胞增殖的影响,采用流式细胞仪测定脾脏中自然杀伤 (NK) 细胞的活性和辅助性 T 淋巴细胞 (Th) 1 和 Th2 分泌的细胞因子的量。结果 鞣花酸对脾淋巴细胞的增殖无明显影响,鞣花酸 (10、50 mg/kg) 明显增强 NK 细胞的活性,对细胞因子的分泌有轻微影响。结论 鞣花酸主要通过影响 NK 细胞活性而起到一定的免疫调节作用。     

偏头痛患者和对照者血浆细胞因子水平的比较

背景:在偏头痛期间,三叉-血管环路中的初级传入神经元释放血管活性肽和降钙素基因相关肽(CG RP)。生理浓度的CG R P和可能通过刺激其在T细背景:在偏头痛期间,三叉-血管环路中的初级传入神经元释放血管活性肽和降钙素基因相关肽(CG RP)。生理浓度的CG R P和可能通过刺激其在T细胞表面选择性受体触发细胞因子分泌。细胞因子在一些诸如免疫、炎症和疼痛的生理和病理过程中起着重要作用。目的:在偏头痛患者和健康对照者中研究血浆促炎和抗炎细胞因子水平。方法:采用ELISA法对25例处于发作期和间歇期的偏头痛患者和18例健康对照者进行…     

BmKNJX10对大鼠背根神经节神经元外向钾电流的影响

目的:作者运用柱层析和高效液相色谱的方法,从东亚钳蝎毒素中分离纯化获得一个长链组分BmKNJX10, 质谱报告结果显示其相对分子质量为7214。本文研究其对神经元钾电流的影响。　方法:采用全细胞膜片钳技 术,观察了BmKNJX10对大鼠背根神经节(DRG)神经元外向钾电流(IK)的作用。　结果:BmKNJX10以浓度依赖 的方式对IK有明显的促进作用。在刺激电压为+20mV时,10mg/L、30mg/L、50mg/L和70mg/LBmKNJX10对 IK的增大率分别为(17.1±3.9)%(n=4)、(25.1±6.2)%(n=4)、(45.3±2.8)%(n=5)和(70.2±11.1)%(n= 3)。　结论:BmKNJX10具有开放钾通道的功能,可能属于一个新的钾通道毒素多肽。     

From noxiustoxin to scorpine and possible transgenic mosquitoes resistant to malaria

Scorpion venom contains different types of peptides toxic to a variety of organisms whose molecular targets have been described as mainly ion-channels of excitable cells where they cause impairment of function. Based on mouse, cricket, and crustacean bioassays, specific toxins for each group of animals have been found. Chromatographic techniques were used to isolate and chemically characterize these peptides. One of the best-studied peptides is noxiustoxin, a 39-amino acid residue-long peptide specific for K(+)-channels. Hadrurin is another scorpion venom peptide whose activity was shown to be bactericidal to a variety of species. Structural similarities of a newly discovered peptide (scorpine) with those of defensins and cecropins showed that scorpion venom contains peptides toxic to microorganisms and malaria parasites. Scorpine was shown to disrupt the sporogonic development of Plasmodium berghei. Using this system as a model for malaria, we introduced the gene of scorpine into a vector for generation of transgenic flies resistant to the infection by Plasmodium. The final aim of this work is to incorporate this gene under the promoter of proteolytic enzymes of digestive tract of mosquitoes for synthesis and liberation of toxic peptide(s) into stomach of freshly fed mosquitoes potentially carrying Plasmodium gametes. In this manner, a putative transgenic mosquito with these characteristics would secrete a toxic peptide with digestive enzymes into midgut, impairing proper development of Plasmodium, hence controlling malaria, one of the most important tropical diseases worldwide.     

蝎毒多肽促进创伤皮肤溃疡愈合的实验研究

目的研究蝎毒多肽促进皮肤溃疡愈合的作用及其机制。方法 NIH小鼠60只,采用创伤溃疡模型,分成五组,分别为外用无菌生理盐水组（空白组）、外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,贝复济）组（150 AU/cm^2）、蝎毒多肽高、中、低浓度治疗组（4×10^-3、4×10^-4、4×10^-5mg/mL）,给药的3、5、7、9 d测量创面面积,计算溃疡愈合率;采用液体试管法和琼脂稀释法观察体外抑菌作用。结果随给药时间延长,蝎毒多肽治疗组溃疡愈合率逐渐升高,与空白组比较,差异有统计学意义;蝎毒多肽对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.125 0 mg/mL。结论蝎毒多肽具有促进皮肤溃疡愈合及体外抑菌的作用。     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响

目的：探讨东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ对肝癌细胞凋亡的影响及其诱导凋亡的初步机制。 方法：将人肝癌细胞株Hep G2浸润在不同浓度的蝎毒多肽组分Ⅲ溶液中,应用DNA凋亡梯状带分析法和DNA末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL法）测定凋亡的发生及凋亡率;用Western blotting方法观察Bcl-2蛋白和Caspase-3的表达量。 结果：蝎毒多肽组分Ⅲ引起的肝癌细胞株Hep G2凋亡呈剂量依赖性变化。DNA凋亡呈现明显的梯状带电泳行为。经5、10、50、100及200 mg·L^-1蝎毒多肽组分Ⅲ处理12 h 后,肝癌细胞凋亡率分别为（6.1±3.0）%、（15.3±4.9）%、（48.5±5.2）%、（66.7±6.5）%和（91.2±6.9）%。凋亡伴随着bcl-2基因的表达下调,在凋亡过程中Caspase -3被激活。 结论：东亚钳蝎蝎毒多肽组分Ⅲ可以促进人肝癌细胞株Hep G2的凋亡,并且这种凋亡可能与通过下调bcl-2基因和激活Caspase-3途径有关。     

基于毒素多肽BmK NaTx-13的全蝎质控工艺研究

目的 基于毒素多肽建立一种新型的全蝎质量检测工艺。方法 从东亚钳蝎毒液中分离得到了一种新型钠通道毒素BmK NaTx-13,制备并鉴定了BmK NaTx-13的特异性抗体,并通过竞争性ELISA法检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量。结果 建立的竞争性酶联免疫吸附法可快速检测全蝎提取物中的BmK NaTx-13的含量并呈现良好的浓度线性依赖。结论 该研究为全蝎质控提供了一种快速免疫检测方法,为提升全蝎入药质量标准提供了借鉴。      

Transforming growth factor-β1 phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit the activity of keloid fibroblasts

Background Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) is known to have a role in keloid formation through the activation of fibroblasts and the acceleration of collagen deposition. The objective of this current study was to isolate TGF-β1 phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their therapeutic effect on inhibiting the activity of keloid fibroblasts.Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human TGF-β1 as the target to obtain specific phages containing ectogenous model peptides similar to TGF-β1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to select monoclonal phages with good binding activity, which underwent DNA sequencing. MTT assay and apoptosis assessment were used to evaluate the biological effects of the phage model peptides on keloid fibroblasts. Immunofluorescence assay was employed to show the binding affinity of the model peptides on phages causing keloid fibroblasts. Quantitative real-time PCR analysis was carried out to detect the expressions of nuclear factor κB (NF-κB) mRNA, connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and TGF-β receptor Ⅱ (TβRII) mRNA in keloid fibroblasts.Results Specific phages with good results of ELISA were beneficiated. Four phage model peptides were obtained. The data of MTT showed that TGF-β1 and one phage model peptide (No. 4) could promote keloid fibroblasts proliferation,however, three phage model peptides (No. 1-3) could inhibit keloid fibroblasts proliferation. The results of apoptosis assessment showed that the three phage model peptides could slightly induce the apoptosis in keloid fibroblasts. The data of immunofluorescence assay revealed that the model peptides on phages rather than phages could bind to keloid fibroblasts. The findings of quantitative real-time PCR analysis suggested that the expressions of NF-κB mRNA and CTGF mRNA in the three phage model peptide groups decreased, while the expression of TβRII mRNA slightly increased.Conclusions Three phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit keloid fibroblasts proliferation and induce the apoptosis in keloid fibroblasts. They can inhibit the activity of keloid fibroblasts by blocking TGF-β1 binding to its receptor and then regulating the expressions of NF-κB, CTGF and TβRII.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。