反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达

目的 研究乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的影响.方法 分空白组、无关序列(N-ODN)组和反义(ASODN)组,以脂质体包埋后分别转染人恶性黑素瘤细胞株A375,采用原位杂交、免疫组化法检测乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的变化.结果 转染24 h后,ASODN组A375细胞乙酰肝素酶mRNA表达较对照组、N-ODN组均显著下调(P均<0.01);转染48 h后,与对照组、N-ODN组相比,ASODN组A375细胞的乙酰肝素酶蛋白水平均显著下降(P均<0.01).结论 乙酰肝素酶ASODN可下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达.     

角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸(KGFR ASODN)对角质形成细胞生长因子(KGF)促HaCaT细胞增殖效应的抑制作用。方法 HaCaT细胞体外培养,采用绘制生长曲线、MTT实验、集落形成实验研究KGFR ASODN对KGF促增殖效应的抑制作用。采用流式细胞仪研究KGFR ASODN对KGFR表达的影响。结果 反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞的生长速度(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制KGF介导的HaCaT细胞增殖(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2都可抑制KGF诱导的HaCaT细胞集落形成(P<0.05)。HaCaT细胞存在KGFR基础表达,高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞KGFR表达(P<0.05),抑制率呈浓度依赖性,正义序列核苷酸(S-ODN)对KGFR表达无抑制作用(P>0.05)。结论 KGFR ASODN可有效抑制KGFR表达,进而抑制KGF介导的HaCaT细胞过度增殖。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。     

CD147 siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖及CD147表达的影响

目的 研究CD147siRNA转染对恶性黑素瘤细胞株A375中CD147表达及细胞增殖的影响。方法 将前期构建的重组质粒pSUPER/CD147 siRNA稳定转染至恶性黑素瘤细胞株A375中,采用半定量RT-PCR法检测转染细胞中CD147 mRNA的表达。采用MTT法检测转染pSUPER/CD147 siRNA对肿瘤细胞增殖的影响。结果 转染了pSUPER/CD147 siRNA的恶性黑素瘤细胞株A375中CD147 mRNA表达水平显著下调,其在转染后24h、48h和72h的增殖水平均显著下降。结论 siRNA转染能有效抑制恶性黑素瘤细胞株A375中CD147的表达,且能抑制肿瘤细胞的增殖能力。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

γ-干扰素、全反式维A酸对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞表达生存素的影响

目的 探讨γ-干扰素、全反式维A酸(ATRA)对皮肤鳞状细胞癌细胞株(SCL-1)表达生存素的影响。方法 采用RT-PCR、免疫印迹(Western blot)分析方法分别检测γ-IFN、ATRA作用前后SCL-1细胞株生存素mRNA及蛋白表达的差异。结果 γ-IFN处理后,生存素在SCL-1细胞表达较对照组明显下降(P<0.05),且具有时间依赖性和剂量依赖性;ATRA可以增强γ-IFN对生存素的抑制作用。结论 γ-IFN联合ATRA诱导皮肤鳞状细胞癌细胞发生细胞凋亡的机制之一可能与下调生存素的表达相关。     

苯甲酸雌二醇及UVA辐照对体外培养的人皮肤成纤维细胞胶原合成的影响

目的探讨苯甲酸雌二醇对体外培养的人成纤维细胞增殖、胶原合成及其对UVA抑制胶原合成的影响。方法在培养的人成纤维细胞中分别加入不同剂量的苯甲酸雌二醇,继续培养48h,用MTT法测定细胞的增殖情况,同时应用RT-PCR方法检测经不同剂量苯甲酸雌二醇及10J/cm²UVA处理后人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达情况。结果MTT法检测结果显示,苯甲酸雌二醇对体外培养的成纤维细胞增殖无明显促进作用。RT-PCR结果提示,苯甲酸雌二醇处理组两型前胶原的表达水平明显上调(P<0.05),而UVA照射后两型前胶原的表达显著下降,苯甲酸雌二醇可在一定水平对抗其作用(P<0.05)。结论苯甲酸雌二醇对体外培养的成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的合成有一定的促进作用,并可对抗紫外线抑制胶原合成的作用。     

雷公藤内酯醇抑制A375细胞增殖和迁移及CCR7表达的体外实验

目的观察雷公藤内酯醇在体外抑制人黑素瘤细胞A375增殖和迁移的能力及对细胞表面趋化因子受体CCR7表达的影响情况,初步分析其作用机制。方法用CCK-8比色试剂盒检测雷公藤内酯醇对A375细胞增殖的作用,Transwell微孔隔离小室迁移实验检测雷公藤内酯醇对A375细胞体外迁移能力的影响,Western blot法检测雷公藤内酯醇对A375细胞CCR7蛋白表达的影响。结果雷公藤内酯醇以剂量依赖方式抑制A375细胞的增殖,24h的IC50值为0.20μg/mL;雷公藤内酯醇能显著地抑制A375细胞的体外迁移能力(P0.01),侵袭抑制率约为82.84%;经不同浓度雷公藤内酯醇(0μg/mL,0.2μg/mL和0.4μg/mL)处理后,A375细胞中CCR7蛋白表达呈明显下降趋势(P0.05)。结论雷公藤内酯醇具有抗A375细胞增殖和体外迁移能力的作用,其机制可能与下调其表面趋化因子受体CCR7的表达相关,并且该作用呈一定的浓度依赖性。     

血浆骨桥蛋白水平与系统性红斑狼疮活动性的关系

目的 探讨血浆骨桥蛋白与系统性红斑狼疮(SLE)活动程度的关系。方法 采用ELISA方法检测28例健康人与38例SLE患者血浆骨桥蛋白水平,以分析其与SLE活动性变化关系。结果 SLE患者血浆骨桥蛋白水平(420±203)ng/mL明显高于正常对照组(73±14)ng/mL,P<0.001;SLE蛋白尿组(623±88)ng/mL明显高于非蛋白尿组(288±135)ng/mL,P<0.001;活动组(529±143)ng/mL明显高于非活动组(185±66)ng/mL,P<0.001;糖皮质激素治疗后血浆骨桥蛋白水平(142±22)ng/mL与治疗前水平(556±130)ng/mL相比,差异有统计学意义(P<0.001);关节炎组(489±153)ng/mL与非关节炎组(375±222)ng/mL之间差异无统计学意义,P>0.05。血浆骨桥蛋白水平与SLE DAI呈正相关,r=0.93,P<0.001;与C3呈负相关,r=-0.49,P<0.05;与ANA滴度、血细胞沉降率、C4水平无相关性(P>0.05)。结论 血浆骨桥蛋白水平变化与SLE活动程度、肾脏损害及疾病进展有关。     

维胺酯对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨维胺酯对体外培养角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖和分化的影响.方法 将浓度为2,5,10,15,20,25,30 μg/mL的维胺酯作用于培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测维胺酯对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测分化标记物角蛋白10及内披蛋白mRNA的表达水平.结果 2 μg/mL维胺酯处理的HaCaT细胞,48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物剂量加大,抗增殖作用愈明显;当药物质量浓度达到30 μg/mL时,48 h和72 h时的抑制率分别为57.67%和82.00%.与对照组相比,经维胺酯作用48 h后,细胞G₁期比例显著增加,S期与G₂期比例则显著下降,并可抑制G₁/G₂期转换,但对细胞凋亡无影响.细胞内披蛋白mRNA表达水平随维胺酯处理浓度增高而上升,药物浓度达30μg/mL时,表达水平由对照组的40.80%增高至156.12%;而角蛋白10 mRNA表达水平则下降,由96.46%降至14.60%.结论 维胺酯具有抑制角质形成细胞增殖及诱导其分化的作用.     

18味中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响

目的研究中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。方法以MTT法测定培养的B16黑素瘤细胞的增殖活性:NaOH法测定黑素生成量;体外氧化多巴反应方法测定酪氨酸酶活性。结果与空白对照组相比,18种中药乙醇提取物中,有9种提取物对1种以上指标有显著性作用(P<0.05或P<0.01)。沙苑子、甘草、山慈姑、薄荷、苦参、夏枯草、黄芩、黑芝麻、墨旱莲可明显促进B16黑素瘤细胞增殖,甘草、山慈姑、薄荷、苦参、夏枯草、何首乌、黑芝麻、墨旱莲明显增加黑素含量,山慈姑、薄荷、苦参、夏枯草、黑芝麻、墨旱莲明显增加酪氨酸酶活性,山慈姑、薄荷、苦参、夏枯草、黑芝麻和墨旱莲的提取物对3种指标均有显著性作用(P<0.05或P<0.01)。结论山慈姑等6种中药的乙醇提取物具有促进黑素细胞增殖和合成黑素的作用。     

内皮素1对人A375黑素瘤细胞株细胞黏附及细胞黏附分子1表达的影响

目的 探讨内皮素（ET）－1对人A375黑素瘤细胞增殖、黏附、迁移及细胞黏附分子（ICAM）－1表达的影响。方法 MTT法观察ET－1对人A375黑素瘤细胞生长的影响,黏附实验检测细胞黏附,Transwell迁移系统检测细胞迁移,流式细胞仪检测对人A375黑素瘤细胞ICAM－1表达的影响。结果 ET-1在0.002 ～ 0.2 μg/mL浓度范围可促进黑素瘤细胞的增殖、在纤连蛋白上的黏附、通过微孔滤膜及抑制ICAM－1的表达（P < 0.01）,在0.2 μg/mL时作用最强,细胞代谢活性（24 h）、细胞黏附率、ICAM-1含量（24 h）分别为0.327 ± 0.009、163.31 ± 4.05、4.667 ± 0.551;在0.2 ～ 2 μg/mL浓度范围作用相反。结论 ET-1可能通过抑制ICAM-1的表达、促进细胞增殖、黏附及迁移而增强细胞代谢、增加色素形成。     

麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

目的探讨麦冬皂苷B对人黑色素瘤(Melanoma)A375细胞增殖,凋亡和细胞周期的影响以及相关机制。方法麦冬皂苷B处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;免疫印迹法检测麦冬皂苷B对A375细胞PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3表达的影响。结果麦冬皂苷B能抑制A375细胞增殖活力及PI3K/Akt/mTOR通路的活化;麦冬皂苷B促进了A375细胞内Bax和Cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡;麦冬皂苷B阻滞了A375细胞细胞周期,G0/G1期细胞比例明显升高;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了麦冬皂苷B的上述作用。结论麦冬皂苷B能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。     

苦参碱对HaCaT细胞Bcl-2/Bax和Fas/FasL的调控

目的:明确苦参碱对HaCaT细胞Bcl-2/Bax和Fas/FasL表达的影响。方法:体外培养HaCaT细胞,选择第二代细胞对数生长期HaCaT细胞作为研究对象,将细胞随机分为4组:苦参碱2mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL 3组及对照组(加入相同体积的0.9%盐水),孵育48 h后,MTT法测定各浓度下细胞增殖,RT-PCR检测Bcl-2/Bax和Fas/FasL的表达。结果:与对照组相比,当苦参碱浓度为2 mg/mL时,HaCaT细胞增殖活性无明显变化;Bcl-2、Bax、Fas、FasL表达也无明显变化(P0.05)。当苦参碱浓度为10 mg/mL时HaCaT细胞增殖活性较对照组明显下降(P0.001);Bcl-2表达明显下降,Bax表达上升(P0.001);Fas、FasL表达上升(P0.05)。当苦参碱浓度为50 mg/mL时,MTT法检测HaCaT细胞增殖明显抑制(P0.001);同时Bcl-2、Bax、Fas和FasL的变化与10 mg/mL时相似(P0.05)。结论:苦参碱能够调控上皮细胞致炎因子的表达,抑制细胞的增殖。