Stx1B基因克隆、表达及重组蛋白的纯化

目的构建志贺样毒素1B亚单位(Stx1B)的原核表达载体,获取高纯度的Stx1B重组蛋白。方法用PCR法扩增Stx1B,通过基因重组技术克隆入原核表达载体pGEX4T-2,将该重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblot检测。结果重组质粒经诱导后表达分子量为34kD的重组蛋白,Western blot检测显示特异性条带,亲和层析柱纯化后得到重组蛋白的纯度在90%左右。结论成功构建了Stx1B重组质粒,表达并纯化出高纯度重组蛋白,为进一步的生物性质研究奠定了基础。     

2型猪链球菌酪氨酸激酶基因的原核表达及表达产物抗血清的制备

目的制备2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)酪氨酸激酶Cps2C重组蛋白及其抗血清,为进一步研究Cps2C的作用奠定基础。方法采用在线工具对cps2C基因进行生物信息学分析。设计cps2C基因引物,以05ZYH33菌株基因组DNA为模板PCR扩增cps2C基因,构建pET32a:cps2C重组质粒;重组质粒转入感受态E.coli BL21后,IPTG诱导表达Cps2C重组蛋白,经Ni~(2+)亲和层析纯化后用His单克隆抗体进行鉴定。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定抗体效价。结果成功构建pET32a:cps2C表达质粒,获得阳性E.coli BL21Cps2C重组蛋白表达菌株,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白条带单一,相对分子质量为43×10~3,与预期一致;Western blot检测Cps2C重组蛋白可以与His单克隆抗体、感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应。制备的多克隆抗血清效价为1∶819 200,且能与重组蛋白反应。结论原核表达了具有抗原性的Cps2C重组蛋白,制备的鼠源多抗血清能识别Cps2C蛋白,为研究Cps2C蛋白在2型猪链球菌中的作用奠定了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。     

A族链球菌类胶原样蛋白Scl1的原核表达及纯化

目的构建A族链球菌Scl1的重组体并进行原核表达及表达蛋白的纯化,为进一步研究该蛋白的空间结构及其与A族链球菌所引起的多种疾病之间的关系奠定基础。方法根据A族链球菌M1型国际标准菌株SF370基因组设计Scl1基因扩增引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得Scl1目的基因,与原核表达载体pet28a分别通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后进行连接,构建重组质粒Scl1-pet28a,并进行序列测定,与原序列比对确定序列的一致性。将Scl1-pet28a转入E.coli BL21中,用IPTG诱导后经MALDI-TOF-MSMS质谱鉴定Scl1的表达,用AKTA全自动蛋白纯化系统对表达蛋白进行纯化。结果获得序列正确的Scl1基因及原核重组表达质粒Scl1-pet28a,MALDI-TOF-MSMS证实重组质粒能够在E.coli BL21中表达,纯化的表达产物为分子质量单位约50ku的单一Scl1蛋白。结论成功构建了Scl1原核表达载体,在E.coli中表达出目的蛋白并获得纯化蛋白Scl1。     

弓形虫RH株膜蛋白P30的原核表达与鉴定

目的在E.coli中表达弓形虫RH株膜蛋白P30。方法将P30基因定向克隆到pET28b,构建含目的基因的pET28b-P30重组质粒,转化E.coliBL21(DE3),接种含pET28b-P30的BL21(DE3)单菌落于LB培养基,1∶100稀释后用0.2mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定诱导表达产物。结果1构建了重组质粒pET28b-P30,2在E.coli中表达了一分子量约为30kDa的融合蛋白,经Westernblot鉴定正确。结论在E.coli中高效表达了弓形虫RH株膜蛋白P30,并以包涵体形式存在。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化北大核心CSCD

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析

目的将猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因进行原核表达,分析重组蛋白的免疫反应性。方法根据Ts8B3基因序列设计引物,以囊尾蚴RNA反转录的cDNA为模板PCR扩增Ts8B3基因,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。纯化重组蛋白,以囊虫病人血清为一抗,采用Western blot分析其免疫反应性。结果 PCR扩增Ts8B3基因片段为201bp,双酶切和测序显示重组表达质粒构建成功。重组质粒转化BL21后经IPTG诱导4h,以包涵体的形式表达相对分子质量单位(Mr)为33×103的目的蛋白。纯化的重组蛋白能被囊虫病患者血清识别。结论成功构建Ts8B3基因重组质粒,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

一种获得高纯度包涵体蛋白的简便方法

以日本血吸虫SjBMP基因部分编码序列构建SjBMP-pET-28a(+)重组原核表达质粒,并转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达。将经过鉴定的目的蛋白rSjBMP以包涵体形式表达的诱导菌样通过Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)切胶再纯化。用该纯化蛋白制备免疫血清,用蛋白质印迹(Western blotting)检测其免疫反应性。结果显示,经Ni2+-NTA Agarose亲和纯化和SDS-PAGE切胶再纯化,获得高纯度的目的蛋白,回收率>11.0%。用该纯化蛋白免疫家兔制备免疫血清,获得的血清效价高于1∶1 280;Western blotting检测结果表明,用该免疫血清去识别表达的重组蛋白,出现特异的单一条带,表明该纯化蛋白仍保持其抗原性,可用于免疫学相关实验研究。因此,SDS-PAGE切胶纯化后电渗、透析回收是纯化重组包涵体蛋白有效、简便的方法。     

猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273的原核表达及纯化

目的 原核表达猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273。方法 通过PCR方法检测该基因在不同血清型猪链球菌中的分布情况,然后利用获得的猪链球菌2型05SSU0273基因片段, 构建重组表达载体pET32a::05SSU0273。将质粒转入E. coli BL21中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot实验证实目的基因的表达, 然后以His亲和层析柱纯化重组蛋白。结果 在S. suis 2 35个血清型标准株中,有20株分离株扩增出目的条带。重组质粒可在宿主菌中高效表达,经镍柱亲和层析得到相对分子质量为43 kD的重组蛋白。结论 本实验成功获得S. suis 2 MCP蛋白,为研究其在猪链球菌2型致病过程中发挥的作用奠定了基础。     

恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因的克隆、表达及其生物活性分析

目的 体外表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)凝固酶Coa,评价其生物学活性。方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌凝固酶coa基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从S. aureus USA300 CA-MRSA 923 株基因组中扩增coa基因片段,将其克隆至pET-24b(+)表达载体,构建重组表达质粒pET-24b-coa;将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3) 中进行IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE和Western blot对表达的重组Coa(rCoa)进行鉴定,测定rCoa对人血液和兔血浆的凝固活性;最后用纯化的重组蛋白rCoa免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和Western blot分析其免疫原性。结果 构建的重组质粒pET-24b-coa在E.coli BL21(DE3) 中以包涵体形式表达rCoa,分子量约74.8 ku,与预期蛋白大小相符;rCoa在体外具有凝固人全血和兔血浆活性,能刺激小鼠产生高效价的抗Coa特异性抗体。结论 成功地获得了具有良好凝固酶活性和抗原性的金黄色葡萄球菌凝固酶重组蛋白rCoa,为进一步深入研究S. aureus凝固酶Coa的功能及以Coa为靶点的抗金黄色葡萄球菌抑制剂和疫苗的研制奠定基础。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础。方法以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA片段。将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c。将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导目的基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析和纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c。用IPTG诱导该质粒转化的E.coliBL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白。经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白。结论成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础。     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆表达和生物学活性的鉴定

目的利用原核表达系统表达具有生物学活性的产气荚膜梭菌α毒素。方法设计针对α毒素基因的一对引物，用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增出α毒素的全基因。经测序确认正确后，回收的α毒素目的条带与pGEX6p-1表达载体经限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，进行连接，转化大肠杆菌BL21。诱导表达后，做SDS-PAGE电泳，出现特异的表达产物条带。表达产物做溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种小鼠实验。结果构建的重组质粒经内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，发现特异的目的基因条带。SDS-PAGE电泳后，发现重组菌株有特异的表达条带。实验证明表达产物具有溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种后致死小鼠特性。结论重组菌株BL21(pGEX6p-1-epα)表达了具有活性的α毒素蛋白。