乙肝病毒体内外感染模型研究进展

乙肝病毒是威胁人类健康的重要病原体之一。目前,利用针对乙肝病毒和宿主分别建立的细胞模型和动物模型,广泛应用于乙肝病毒的基础研究、新药研发和新疗法的探索。但是,这些模型仍然存在某些方面的缺陷,如感染率低、感染期短,与人存在较大的种属差异等,最重要的是,这些模型无法完全模拟乙肝病毒自然感染人的过程及产生病理变化。本文对近十五年来主要乙肝病毒体内外感染模型及其最新的研究进展进行简要综述,为今后建立新型乙肝病毒感染模型提供参考。     

Tea polyphenols exerts anti-hepatitis B virus effects in a stably HBV-transfected cell line

In this study, the anti-HBV effects of tea polyphenols （TP） were examined. After cells were exposed to TP for 3, 6, 9 days, amounts of HBsAg, HBeAg and HBV-DNA released into the supernatant of the cultured HepG2 2.2.15 cells were detected. TP, to some extent, inhibited the secretion of HBsAg and strongly suppressed the secretion of HBeAg in a dose-dependent （P〈0.01） and time-dependent manner, with 50% maximal inhibitory concentration （IC50） value being 7.34μg/mL on the 9th day, but the time-dependence was not significant （P=0.051）. Expression of HBV-DNA in the supernatant of the cell culture also was significantly decreased in a dose-dependent fashion （P〈0.01）. The ICS0 of TP in inhibiting HBV DNA was 2.54 pg/mL. It concluded that TP possessed potential anti-HBV effects and may be used as a treatment alternative for HBV infection.     

知母宁抗乙肝病毒作用的实验研究

目的 观察知母宁抗乙肝病毒的作用.方法 观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及对乙肝模型鸭DHBV-DNA的影响.结果 知母宁浓度为4mg/ml时对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用;以200mg/kg治疗乙肝模型鸭10d后DHBV-DNA水平明显降低.结论 知母宁有抗乙肝病毒的作用,其机制可能与抑制HBV-DNA的复制有关.     

乙肝病毒携带者PBMC细胞中Toll样受体2表达水平与乙肝病毒增殖相关性研究

目的：探讨乙肝病毒（HBV）增殖与无症状乙肝病毒携带者（ASC）外周血中Toll样受体2（TLR2）表达水平的相关性。方法：分离乙肝病毒携带者和健康志愿者外周血单个核细胞,分别用免疫细胞化学染色方法检测TLR2在细胞表面的表达情况;用RT-PCR方法检测TLR2的mRNA水平;用ELISA法检测乙肝病毒携带者和健康志愿者血清中TLR2活化后产物TNF-α的表达水平。结果：HBV复制活跃组的外周血单个核细胞中TLR2在蛋白水平和mRNA水平表达明显低于HBV复制不活跃组和健康对照组;HBV复制活跃组血清中TNF-α水平显著低于HBV复制不活跃组。结论：乙肝病毒携带者外周血单个核细胞TLR2的表达及活化与乙肝病毒的增殖有相关性。     

吉西他滨促进HepG2.2.15细胞系中乙肝病毒pgRNA转录和病毒复制及相关分子机制研究

目的：探讨吉西他滨对HepG2.2.15细胞中乙肝病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pgRNA）转录以及乙肝病毒复制的影响及其可能的作用机制。方法：使用不同浓度吉西他滨处理HepG2.2.15细胞,分别使用CCK-8法、流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、细胞内乙肝病毒pgRNA、细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原（hepatitis B sur－face antigen,HBsAg）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen,HBeAg）、乙肝病毒DNA（hepatitis B virus DNA,HBV DNA）;实时定量PCR法检测吉西他滨作用下HepG2.2.15细胞中与pgRNA转录有关的调控基因肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4,HNF4α）、P38蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK）、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1（CAMP responsive element binding protein 1,CREB1）、核转录因子 p65（nuclear factor-kappa B p65,NF-?资b p65）、组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1,HDAC1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α）、叉头转录因子O1（forkhead box protein O1,FOXO1）、相关调控基因沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin 1,SIRT1）、P53 mRNA水平以及pgRNA的表达量,分析这些基因随吉西他滨浓度变化与pgRNA随浓度变化的相关性,找出与pgRNA变化相关性最高的基因,并使用Western blot在蛋白质水平验证吉西他滨对此基因蛋白质表达量的影响。结果：吉西他滨对HepG2.2.15细胞的生长显示出浓度以及剂量依赖性的抑制作用;吉西他滨使细胞凋亡率增高;吉西他滨使细胞更多的细胞停滞在G0G1期,而处于S期细胞比例降低;吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞内乙肝病毒 pgRNA,72 h之内呈现明显的时间与剂量依赖性;吉西他滨作用细胞24 h会使细胞培养上清液中的HBeAg增加;吉西他滨促进HNF4α mRNA、HNF4α蛋白质表达量增加,且在所检测的与乙肝病毒转录调节有关的基因中,HNF4α mRNA变化趋势与HBV pgRNA变化趋势相关性最高。结论：吉西他滨可在细胞水平促进乙肝病毒pgRNA转录以及乙肝病毒的复制,其机制为通过促进乙肝病毒转录因子HNF4α的表达实现的。     

肝组织中Fas/FasL的表达与慢性乙型肝炎的关系

目的 :探讨肝组织中Fas/FasL表达与慢性乙型肝炎的关系。方法 :30例慢性乙型肝炎患者肝穿刺肝组织病理检查及免疫组化SP法检测肝组织中的Fas/FasL、HbcAg。结果 :肝组织中Fas、FasL表达强度与HBcAg在肝组织表达呈正相关 (P <0 0 0 1) ,与慢性肝炎病理损伤的程度即炎症活动度呈正相关 (P <0 0 0 1) ,与肝纤维化程度呈正相关 (P <0 0 0 1)。结论 :HBV持续感染及复制可诱导肝细胞表达Fas/FasL ,其表达程度随着慢性肝炎病理损伤的程度即炎症活动度及肝纤维化程度加重而增强。Fas -FasL系统介导的细胞凋亡 ,确实参与了慢性乙型肝炎的发病机制 ,且在慢性乙型肝炎的发生发展中起重要作用。     

非小细胞肺癌肝转移与乙肝病毒感染关系

目的探讨乙肝病毒感染与非小细胞肺癌(NSCLC)肝转移的关系.方法回顾性分析2003年1月~2010年1月收治的非小细胞肺癌患者480例,比较乙肝病毒感染的NSCLC和非乙肝病毒感染的NSCLC两组肝转移的发生率.结果乙肝病毒感染组同时、异时肝转移发生率为分别为13.2%和5.9%,非乙肝病毒感染组同时、异时肝转移发生率为21.6%和9.5%,两者相比差异显著(P<0.05).结论乙肝病毒感染的NSCLC肝转移发生率比非乙肝病毒感染组低,前者很少发生肝转移.     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV-DNA检测的临床意义

目的 研究HBV感染者血清及外周血单个核细胞(PBMC)中HBV-DNA的感染情况.方法 采用荧光定量PCR技术对112例乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA的感染情况进行检测.结果 PBMC内HBVDNA阳性60例,阴性52例;PBMC内HBV-DNA阳性患者HBeAg阳性率68.3%,较PBMC内HBV-DNA阴性患者显著增高(P＜0.05);血清和PBMC检测结果一致的患者占总检出率的79.5%.肝硬化组PBMC内HBV-DNA阳性率高于急性乙型肝炎组和慢性肝炎组(P＜0.05).结论 血清与PBMC内HBV-DNA阳性率以及HBeAg阳性率存在明显的相关性.PBMC中HBV-DNA的持续存在可能与乙肝易慢性化有关.     

三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究

目的 研究三叶青4个提取部位对乙肝病毒的抑制作用.方法 运用mT法检测样品药物导致50%细胞死亡的数值浓度为CC50;用ELISA方法检测样品药物达到抑制HbsAg、HbeAg分泌,以及运用荧光定量PCR法检测样品药物抑制病毒DNA复制量的50%时的浓度数值为IC50.结果 三叶青4个提取部位对乙肝病毒分泌的HbsAg、HbeAg均有抑制作用.结论 三叶青乙酸乙酯部位对乙肝病毒具有较强活性,能明显降低HBV的DNA复制水平,可进一步从中提取分离具有更强生物活性的物质,为新药开发提供物质基础.     

1.1倍全长HBV基因组克隆转染细胞系的建立

目的构建pneo-CH9/3091真核表达质粒,并建立其稳定表达的HepG2细胞系。方法质粒pCH9/3091包含HBV1.1倍体和CMV启动子,将PCR扩增出的带有新霉素(neo)抗性的基因片段插入pCH9/3091构建成重组质粒pneo-CH9/3091。重组质粒经酶切,测序验证正确后,通过脂质体介导转入人肝癌细胞HepG2。G418筛选后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所得单克隆细胞培养上清液的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),PCR检测细胞上清液的病毒颗粒,Western blot检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达,以及Southern blot检测细胞内核心颗粒HBV DNA的复制情况。结果有3株细胞系培养上清HBsAg和HBeAg检测呈现阳性,且HBV C区片段可通过PCR扩增出来,West-ern bot结果提示只有细胞株HepG2-H7可以表达HBV核心蛋白。Southern blot结果说明此细胞株基因组中有HBV基因组的稳定整合,并且能在细胞内检测出HBV DNA复制中间体。结论成功构建1株HBV稳定整合细胞株HepG2-H7,能持续产生HBV病毒颗粒。     

雌二醇和地塞米松调节乙型肝炎病毒抗原的表达

对雌二醇和地塞米松调节乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒θ抗原(HBeAg)表达的研究结果表明,10~(-6)mol/L雌二醇和10~(-6) mol/L地塞米松都能增加乙型肝炎病毒-DNA转染人体肝癌细胞株2·2·15细胞分泌HBsAg和HBeAg,雌二醇的作用明显强于地塞米松。未发现该两类激素之间有协同或拮抗作用。作者对乙型肝炎(乙肝)发病与性激素的关系及乙肝疫苗生产途径的设想进行了讨论。     

乙肝病毒感染者T细胞亚群状态与肾脏损害的关系

目的：探讨Ｔ细胞亚群变化在乙肝病毒相关肾炎发病中的作用。方法：利用流式细胞仪,检测３０ 例乙肝病毒感染后发生肾损害者周围血ＣＤ４＋ 、ＣＤ８ ＋ 细胞的变化;并对６ 例经肾活检证明为乙肝病毒相关肾炎患者用免疫组化ＡＢＣ法检测肾组织ＣＤ４＋ 、ＣＤ８ ＋ 细胞浸润情况。结果：乙肝病毒感染后发生肾损害组周围血ＣＤ８＋ 细胞明显升高（Ｐ＜ ０．０５）;ＣＤ４＋ ／ＣＤ８ ＋ 明显下降（Ｐ＜ ０．０５）,与２４ ｈ 尿蛋白定量呈负相关（ ｒ＝ － ０．５５９６,Ｐ＜ ０．０５）;乙肝病毒相关肾炎患者肾组织ＣＤ４＋ 、ＣＤ８ ＋ 细胞数明显增加（ Ｐ＜ ０．０５）。结论：乙肝病毒感染后发生肾损害者存在周围血Ｔ细胞亚群失衡;不仅特异性体液免疫,而且特异性细胞免疫及非特异性免疫机理也参与乙肝病毒相关肾炎发病     

知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究

目的:观察知母宁的抗乙肝病毒作用。方法:观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及对乙肝模型鸭DHBV-DNA的影响。结果:知母宁浓度为4mg/mL时对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用;以200mg/kg治疗乙肝模型鸭10d后DHBV-DNA水平明显降低。结论:知母宁有抗乙肝病毒的作用,其机制可能与抑制HBV-DNA的复制有关。     

恩替卡韦抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞变化的影响

目的 研究恩替卡韦(entekavir,ETV)治疗慢性乙型肝炎患者过程中Th17细胞的变化.方法 在应用ETV治疗的不同时间点抽取HBV感染患者及健康对照者静脉血,分离血清及外周血单核细胞(PMBC),检测血清中乙型肝炎病毒表面标志物(HBV-M)、乙型肝炎病毒核酸定量(HBV DNA)、丙氨酸转移酶(ALT)以及外周血中的Th17细胞的频数.结果应用ETV治疗后患者ALT及HBV DNA从4周开始出现明显下降, IL-17+ 及IL-17+IFN-γ-T细胞的频数在第4周时明显升高[IL-17+(6.32±2.26)%, IL-17+IFN-γ-T(4.68±1.73)%],其后逐渐下降至24周,在48周时接近于基线点,在所有时间点均高于健康对照(P<0.05).IL-17+IFN-γ+ T细胞的频数第4周时明显升高,在36周时达到峰值[IL-17+IFN-γ+ T(1.92±0.97)%],在48周时明显下降,但在所有时间点明显高于健康对照(P<0.05).结论 ETV在有效抑制病毒复制的同时,能够降低体内Th17细胞的频数,意味着体内炎症反应的减轻,同时也可能削弱机体清除病毒的能力.     

软肝饮对HBV转染细胞表达功能抑制的实验研究

目的 :观察软肝饮对HBV转染细胞表达功能的影响。方法 :本研究以乙型肝炎病毒 (HBV)转染细胞 (2 2 15细胞系 )作为筛选抗HBV药物的细胞模型 ,观察了纯草药方软肝饮对 2 2 15细胞分泌HBV表面抗原(HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的影响 ,并以抗病毒药物无环鸟甘为对照。结果 :软肝饮对 2 2 15细胞无明显毒性作用 ,同时显著抑制HBsAg成分。结论 :提示软肝软在体外有一定的抗病毒作用。     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建变异核壳蛋白融合表达载体pEGFP-V60和pEGFP-L97和变异按壳蛋白阳性HepG2细胞椿；荧光显微镜和western blotting检测按壳蛋白表达；以TNF-α、Act—D谤导HepG2细胞株凋亡。0、16、32h和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡，32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立融合蛋白表达载体和融合变异极壳蛋白表达细胞系，各细胞株核壳蛋白表达量基本相同；16、32、48h时，pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97表达细胞椿凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株（P〈0．05）；32h和48h时。pEGFP-V60和pEGFP-L97细胞株凋亡率均明显高于pEGFP-WT细胞椿（P〈0．05）；32h时激光典聚焦检测结果一致。结论乙型肝炎病毒L60V、I97L变异按壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株按壳蛋白不同。L60V、I97L变异可能是慢性肝炎活动的原因之一。     

树突状细胞抗乙肝病毒免疫和抗肝癌免疫

Ｔ细胞介导的免疫应答在抗肿瘤免疫和抗病毒免疫中起主导作用 ,Ｔ细胞的致敏激活和扩增依赖于抗原提呈细胞(ＡＰＣ)提呈相应的抗原多肽和提供共刺激信号 ,分泌Ｔｈ1型应答主导因子 ,诱导机体生成抗原特异性ＣＴＬ ,并通过细胞溶解机制和非细胞溶解机制对肿瘤或病毒产生杀伤或抑制 ,因而ＡＰＣ是启动机体产生抗肿瘤免疫和抗病毒免疫的中心环节 ,能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。ＡＰＣ包括树突状细胞 (Ｄｅｎｄｒｉｔｉｅｃｅｌｌｓ,ＤＣ)、巨噬细胞、Ｂ细胞等 ,其中ＤＣ是机体最有效、功能最强的抗原提呈细胞 ,…