不同剂量和作用时间地塞米松对大鼠骨密度和成骨细胞作用的研究

目的观察地塞米松(Dex)不同剂量及不同作用时间对大鼠骨量、成骨细胞的影响。方法 120只3月龄SD雌性大鼠,随机分对照组(生理盐水)、小剂量组(地塞米松1 mg/kg)、中剂量组(地塞米松2.5 mg/kg)、高剂量组(地塞米松5 mg/kg),每组30只,2次/周肌内注射,分别干预4 w、9 w、12 w。给药前及干预后采用双能X线骨密度仪测大鼠全身骨密度(BMD),免疫组化法检测骨组织碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白表达。从新生SD大鼠颅骨体外分离培养成骨细胞,随机分为5组:空白对照组、5×10-8mol/L Dex组、5×10-7mol/L Dex组、5×10-6mol/L Dex组、5×10-5mol/L Dex组,分别培养12h、24 h、48 h后,采用CCK8法检测成骨细胞增殖,采用RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA、I型胶原mRNA表达。结果 (1)干预4 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度与对照组无差异(P0.05)。干预9 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),高剂量组大鼠骨密度低于小剂量组(P0.05);干预12 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P0.05),且随着剂量的增加,大鼠的骨密度逐渐降低。(2)干预4 w,ALP、I型胶原蛋白表达与对照组无差异(P0.05);干预9w,中剂量和高剂量组大鼠骨组织I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05),不同剂量组大鼠骨组织ALP蛋白表达均低于对照组(P0.05);干预12 w,大鼠骨组织ALP、I型胶原蛋白表达均低于对照组(P0.05);随着Dex剂量的增加,大鼠骨组织ALP及I型胶原蛋白表达逐渐降低。(3)体外分离培养成骨细胞干预12 h,5×10-6mol/L Dex和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨细胞增殖(P0.05),5×10-5mol/L Dex组成骨细胞的ALP、I型胶原mRNA表达减少(P0.05);干预24 h及48 h,不同浓度Dex均明显抑制成骨细胞增殖(P0.05),ALP、I型胶原mRNA表达明显减少(P0.05),呈剂量和时间依赖性。结论地塞米松可能通过抑制成骨细胞的增殖及骨形成,导致SD大鼠骨密度降低。     

重组人胰岛素样生长因子I对大鼠成骨细胞增殖、凋亡及I型胶原蛋白合成的影响

目的观察胰岛素样生长因子I(IGF-I)对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及I型胶原蛋白合成的影响,探讨IGF-I对骨代谢影响的可能机制。方法不同浓度rhIGF-I刺激体外培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力;肿瘤坏死因子α(TNF-α)单独或与rhIGF-I共同刺激成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;rhIGF-I刺激成骨细胞,免疫细胞化学结合计算机图像分析系统检测I型胶原蛋白的表达。结果一定浓度IGF-I能明显增加成骨细胞数量(P<0·05),在0·1~100ng/ml这种作用与IGF-I的浓度呈正相关;TNF-α在0·1~100ng/ml浓度范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡(P<0·05),并使S期细胞减少(P<0·05),而IGF-I能抑制TNF-α对成骨细胞的促凋亡作用(P<0·05);经IGF-I的刺激,成骨细胞I型胶原蛋白的表达明显高于对照组(P<0·05)。结论IGF-I对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用,在0·1~100ng/ml之间呈浓度依赖性,IGF-I能抑制TNF-α诱导的大鼠成骨细胞凋亡,IGF-I能促进大鼠成骨细胞I型胶原蛋白的合成。     

异烟肼、利福平联合应用对体外培养成骨细胞生物活性的影响

目的研究不同浓度的异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)联合应用对大鼠成骨细胞(osteoblast,OB)增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、I型胶原蛋白表达和成骨细胞成熟与矿化能力的影响。方法分离、培养新生SD大鼠乳鼠颅骨OB,分别采用CCK-8法、碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性、免疫荧光染色法和茜素红染色法检测,观察不同浓度INH+RFP [(10+3)μg/mL、(20+6)μg/mL、(30+12)μg/mL、(40+24)μg/mL、(50+48)μg/mL]对成骨细胞增殖、ALP活性、Ⅰ型胶原蛋白表达以及矿化能力的影响。结果与对照组相比,当INH+RFP的浓度在(20+6)μg/mL及以上时,抑制大鼠OB增殖、I型胶原合成、使ALP活性及矿化能力显著下降(P0.05),且均随着浓度增加而加强抑制作用。结论 INH、RFP联合用药较低浓度对成骨细胞有抑制作用,因此,骨关节结核病灶清除术后,局部用药应该严格控制药物浓度。     

不同浓度生长分化因子-5对内侧副韧带成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的 观察生长分化因子-5(GDF-5)对内侧副韧带(MCL)成纤维细胞增殖能力及胶原合成的影响. 方法 体外培养10周龄SD大鼠MCL成纤维细胞,分别加入不同浓度GDF-5,分为4组:0 ng/mL组、10 ng/mL组、50 ng/mL组、100 ng/mL组,用CCK-8法测定细胞增殖能力,羟脯氨酸测试盒测定细胞总胶原含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测I与Ⅲ型胶原mRNA的表达. 结果 浓度为10、50、100 ng/mL的GDF-5均能增强MCL成纤维细胞的增殖能力,以100 ng/mL的GDF-5作用最显著,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MCL成纤维细胞中加入GDF-5后,羟脯氨酸量增加,I型胶原mRNA表达增加,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05),但Ⅲ型胶原mRNA表达组间比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 GDF-5可以促进MCL成纤维细胞增殖及胶原合成进而促进韧带损伤愈合.     

鞣酸在骨关节炎中软骨保护作用的实验研究

[目的]探究鞣酸(GA)在晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导的骨关节炎中对软骨细胞的保护作用。[方法]首先通过应用晚期糖基化终末产物处理实验动物兔软骨细胞探索AGEs对于软骨细胞的负面作用;然后通过对离体软骨细胞代谢过程中活性氧、II型胶原蛋白、蛋白聚糖、一氧化氮合成酶和环氧化酶-2的测定,以及兔血清COMP和TNF-α的测定,观察GA在经AGEs处理的软骨细胞中的软骨保护作用。[结果]暴露于AGEs作用下的离体实验动物兔软骨细胞中,II型胶原蛋白和蛋白聚糖水平下降,而活性氧、一氧化氮合成酶、环氧化酶-2以及兔血清COMP和TNF-α水平升高,变化差异有统计学意义;相比之下经GA预处理的软骨细胞暴露于AGEs后,活性氧的释放仅有微弱的增加;AGEs介导的II型胶原和蛋白聚糖的降解可以被GA所阻断;由AGEs介导的i NOS和COX-2的表达受到抑制,兔血清COMP和TNF-α水平同时被GA所抑制。[结论]鞣酸可以在AGEs介导的骨关节炎中对动物软骨细胞起到保护作用,从而作为一种潜在的药物治疗方法延缓骨关节炎的进展。     

过表达COLIA1 cDNA腺病毒感染TT型成骨细胞株后 对其生物学性能影响的研究

目的本实验前期研究发现I型胶原α1链基因-1997G→T纯合突变可降低成骨细胞生物学性能。现利用基因重组技术提高TT型成骨细胞COLIA1基因mRNA的表达水平,观察能否逆转COLIA1基因-1997G→T突变对TT型成骨细胞生物学性能的影响。方法构建过表达COLIA1基因的腺病毒载体,并感染TT型成骨细胞。比较感染后TT型成骨细胞I型胶原α1链mRNA的表达水平、I型胶原的含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量的差异。结果过表达COLIA1基因的腺病毒载体感染后,TT型成骨细胞I型胶原α1链mRNA的表达水平、I型胶原的含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量较未感染组及空病毒组有显著提高,差异有统计学意义。结论利用腺病毒载体提高TT型成骨细胞的I型胶原α1链mRNA的表达水平,可增加I型胶原的含量、细胞基质钙含量以及钙结节数量。TT型成骨细胞I型胶原合成的减少导致细胞外基质减少,导致钙质沉着部位不足可能是-1997G/T患者BMD降低的原因。     

小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

目的 建立小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型,为探讨成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法 利用24 h内新生小鼠颅骨和4～8周龄成年小鼠四肢长骨分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞,采用间接接触的培养模式将接种了骨髓单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养一定时间后进行破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定和骨吸收功能检测,并进一步采用RT-PCR对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和组织蛋白酶K (Cathepsin K ) 的表达进行检测.结果 共培养5天后可见TRAP( )多核细胞形成,13天TRAP( )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现,随着培养时间的延长,陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因TRAP 在共培养3天时开始表达,而MMP-9和 Cathepsin K则在共培养5天后表达.结论 共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用显著,诱导的破骨细胞具有噬骨能力,该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.     

新型钽铌多孔支架材料的细胞生物相容性研究

[目的]研究多孔钽铌(Ta-Nb)材料的细胞相容性。[方法]将兔成骨细胞与多孔钽铌材料共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖、扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达。[结果]CCK-8检测显示实验组多孔钽铌材料上细胞的增殖与空白对照组没有差异性(P﹥0.05);扫描电镜观察到细胞在多孔钽铌的表面和孔隙内大量黏附、增殖和生长,随着共培养时间的增加,材料表面的细胞数量明显增多;RT-PCR显示随着共培养时间的增加,Ⅰ型胶原基因的表达增强(P﹤0.05),骨钙素的表达无明显差异(P﹥0.05)。[结论]多孔钽铌支架材料适于成骨细胞的黏附、生长和分化,具有良好的细胞相容性。     

体外高磷环境下血管平滑肌细胞转分化过程的研究

目的 观察体外高磷培养条件下,血管平滑肌细胞（VSMC）向类似成骨样细胞转分化的动态变化特点。 方法 Western印迹和免疫荧光法观察不同磷浓度（1.0、2.5、3.5 mmol/L）培养条件下,人VSMC的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及成骨细胞特异性的核转录因子Cbfα1、相关骨基质蛋白（骨桥蛋白、I型胶原和骨钙素）的动态变化过程。实时荧光定量PCR法分析上述指标的基因表达水平。在此基础上,以硝酸银染色和茜素红染色了解细胞的钙盐沉积状况,最后通过电镜观察不同培养条件下细胞超微结构的改变。 结果 在无血清的培养条件下,高磷（2.5、3.5 mmol/L）刺激细胞12 h时,胞内 Cbfα1的表达就明显增加（P ＜ 0.05）;3 d后高磷组（2.5、3.5 mmol/L）细胞中I型胶原和骨桥蛋白的含量显著上调（均P ＜ 0.05）;第6天骨钙素的产生开始增加;15 d时高磷组（2.5、3.5 mmol/L）α-SMA的含量才显著下降（P ＜ 0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,高磷环境培养1 d时,细胞中骨桥蛋白、I型胶原的mRNA水平显著升高（均P ＜ 0.05）;5 d时骨钙素的mRNA表达显著增加（P ＜ 0.05）;10 d时α-SMA的mRNA含量显著减少（P ＜ 0.05）。在高磷营养液中培养15 d时,细胞出现多处斑片状的钙盐沉积。电镜可见胞质内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡。 结论 高磷可诱导VSMC向类似成骨样细胞转分化,这是一个复杂的、有多个环节、有序的动态变化过程。     

晚期糖基化终末产物通过Wnt/β-catenin信号通路调控足细胞自噬和迁移

目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导Wnt/β-catenin信号通路活化对足细胞自噬和迁移的影响。方法将小鼠永生化肾足细胞系分为牛血清白蛋白组(100mg/L BSA)、糖基化终末产物组(100 mg/L BSA-AGEs)和糖基化终末产物+DKK-1组(100mg/L BSA-AGEs+100 DKK-1 mg/L),以未加干涉的正常足细胞为对照组。Western blot检测足细胞β-catenin蛋白、自噬膜蛋白微管相关蛋白轻链3-II(LC3-Ⅱ)以及自噬底物p62蛋白表达水平,免疫荧光观察足细胞自噬情况,ELISA检测细胞上清液中Nephrin蛋白含量,划痕试验检测足细胞迁移能力。用AGEs和AGEs+RAGE(糖基化终末产物受体)中和抗体处理足细胞系,Western blot检测足细胞β-catenin蛋白的表达。结果与对照组相比,AGEs组p-β-catenin、p62表达升高(P0.05),LC3-Ⅱ表达降低(P0.05)。AGEs+DKK-1组p-β-catenin、p62蛋白表达较AGEs组降低,LC3-Ⅱ表达升高(P0.05),但与对照组比较差异无显著性(P0.05)。BSA组各指标与对照组均无显著性差异(P0.05)。免疫荧光检测发现AGEs组足细胞中LC3荧光强度较对照组明显减弱,AGEs+DKK-1组较AGEs组LC3荧光强度增强,BSA组与对照组比较差异无显著性(P0.05)。AGEs组细胞培养上清中Nephrin含量较对照组明显降低(P0.05),AGEs+DKK-1组较AGEs组升高(P0.05),但仍低于对照组(P0.05),BSA组与对照组差异无显著性(P0.05)。与对照组相比,AGEs组足细胞迁移能力降低(P0.05),AGEs+DKK-1组、BSA组与对照组比较,差异无显著性(P0.05)。AGEs+RAGE中和抗体处理的足细胞β-catenin蛋白水平较AGEs组显著降低(P0.05)。结论 AGEs通过RAGE激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制足细胞自噬和迁移能力,可能是糖尿病患者足细胞损伤机制之一,在糖尿病肾病的发生和进展中发挥重要调控作用。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。