犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究

目的 研究犬骨髓间充质干细胞(MSC)体外诱导分化为胰岛样细胞的可能性.方法 分离纯化犬骨髓MSC,予EGF、bFGF和β细胞调节素、尼克酰胺、B27添加剂诱导.双硫腙染色、 Western blot、免疫荧光染色、胰岛素分泌量测定和葡萄糖刺激胰岛素释放试验鉴定诱导前后的细胞功能.结果 未诱导细胞呈长梭形贴壁生长,诱导第2周细胞逐渐变圆,聚集成团,双硫腙染色呈棕红色;Western blot检测诱导后细胞表达PDX-1;免疫荧光染色显示诱导后细胞表达胰岛素、胰升血糖素、生长抑素; ELISA结果表明诱导后细胞可分泌胰岛素,体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性.结论 犬骨髓MSC在体外能被诱导分化为胰岛样细胞.     

体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的:体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化(BMSCs)为肝样细胞,提高分化效率.方法:将第一代BMSCs随机分为诱导组和对照组.诱导组加肝细胞生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、抑瘤素M等进行诱导培养,观察细胞形态,检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(A1b)、细胞角蛋白18(CK18)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和细胞色素P450 2b9(CYP2b9)的mRNA表达,A1b合成以及A1b和CK18蛋白标记细胞阳性率.结果:诱导组第3天出现多边形细胞,5—7d上皮样细胞呈岛状分布,14 d呈铺路石状.对照组细胞为长梭形.第7,14,21天,诱导组细胞AFP,A1b,CK18 mRNA和A1b蛋白检测阳性;第14,21天,细胞表达TAT和CYP2b9 mRNA.对照组除AFP mRNA呈弱阳性外,其余均为阴性.第7,14,21天,诱导组CK18阳性率分别为71.4%.75.9%,80.6%:A1b阳性率分别为75.0%,79.7%.81.1%.而对照组第7天CK18和A1b阳性率仅2.3%,1.7%,与诱导组相比有显著差异(P_(CK18)=1.97×10~(-5),P_(A11b)=3.08×10~(-6)).结论:BMSCs在体外可以被诱导分化为肝样细胞,诱导率最高可达80%以上.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞诱导分化的机制

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外向心肌细胞(CM)定向诱导分化的机制.方法 全骨髓贴壁法体外获取大鼠BMSC,流式细胞术检测CD44、CD45和CD105的表达率对其进行鉴定,以未加一抗只加二抗的BMSCs作为平行对照组.选用生长良好、纯度达到95％的P5代BMSCs,用5-氮杂胞苷(5-Aza)10 μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponineI的免疫组化检测.在诱导前及诱导2e以RT-PCR方法检测RhoA的表达变化.结果 体外分离纯化培养扩增出大鼠BMSCs,表达CD44、和CD105.经10 μmol/L 5-Aza诱导分化的BMSCs表达心肌特异性标记TroponineI;RT-PCR的结果显示,诱导后的BMSCs表达RhoA.结论 BMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10 μmol/L.5-Aza体外可能通过RhoA途径在BMSCs分化为心肌细胞过程中起着重要调控作用.     

体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的 探讨体外诱导人羊膜间充质干细胞(hAD-MSCs)向胰岛素分泌细胞分化潜能.方法 采用胰蛋白酶-胶原酶消化法分离提取hAD-MSCs,流式细胞术分析和免疫细胞化学染色行表型鉴定.取第3代按2.5× 106个/ml或5×105个/ml细胞密度接种6孔培养板或预置盖玻片的24孔培养板,在含10mmol/L尼克酰胺和N2补充物的无血清HG-DMEM培养基培养,未诱导组为含10％胎牛血清的LG-DMEM基础培养基.分别于体外诱导第7、14、21天采用免疫细胞化学法检测胰岛素和β2微球蛋白的表达,采用放射免疫法检测上清液中胰岛素含量,采用RT-PCR检测胰岛素mRNA和胰十二指肠同源异型盒因子1(PDX-1)mRNA的表达.结果 (1)hAD-MSCs高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD44、CD73、CD166及波形蛋白;(2) hAD-MSCs诱导第7、14、21天胰岛素阳性细胞百分率分别为74.67％±1.53％、75.00％±1.00％、74.33％±1.53％,培养物上清液中胰岛素含量分别为(331.62±1.76)、(330.50±1.22)和(331.65±0.48) μIU/ml,各时点间比较无显著性差异(均P＞0.05),而未诱导组仍未见胰岛素阳性细胞;培养上清也未检测到胰岛素;(3) hAD-MSCs诱导前后均有PDX-1 mRNA和蛋白表达,胰岛素基因mRNA表达仅见于诱导组;(4) hAD-MSCs诱导组和未诱导组各时点均有β2微球蛋白表达,其阳性细胞百分率组间差异无显著性(均P＞0.05).结论 hAD-MSCs具有向胰岛素分泌细胞分化的能力,可能成为1型糖尿病细胞移植治疗的新的细胞供源.     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）在不同的诱导条件下可向心肌细胞（CM）分化,但目前对于MSCs心肌化过程中的信号分子、具体途径及基因调控等均不太明确。本文对MSCs向心肌细胞分化的实验条件及目前研究可能包含的分子机制作一综述。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

<正>骨髓间充质干细胞(BMSCs)又称骨髓基质干细胞,是骨髓内的一类非造血干细胞,它能够分化为多种中胚层来源的间质细胞。心肌细胞不具备再生能力,故损伤的心肌细胞无法通过自身的增殖和分化来修复,心肌梗死、心衰、心肌重构等均为传统医学方法难以医治的顽疾。近年研究发现,BMSCs在一定的诱导条件下,可以分化为心肌细胞。BMSCs具备易获得性、多     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的实验研究

采用密度梯度离心法分离出胸骨骨髓间充质干细胞（HBMCs），经体外培养、扩增、纯化后，加入诱导因子定向诱导为内皮细胞（ECs），并对细胞进行鉴定。证实HBMCs在特定环境下可分化为ECs，以HBMCs诱导为ECs作为种子细胞具有可行性。     

人骨髓间充质干细胞体外纯化及心肌样细胞定向诱导分化后的特征分析

目的在体外将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）进行纯化、扩增及向心肌样细胞定向诱导分化，并对诱导后的细胞进行心肌样细胞相关特性分析。方法采用体外纯化、扩增后的第4代hMSCs在体外经5μmoL／L5-杂氮胞苷诱导24h后继续培养8W，相差显微镜下观察细胞形态变化，免疫组化方法鉴定心肌特异性蛋白心房钠尿肽（ANP）和连接蛋白（CX43）的表达，流式细胞仪检测诱导前后细胞表面抗原（CD31、CD34、CD45、CD90）的表达情况，应用RT—PCR技术分析肌球蛋白重链（β—MHC）和肌钙蛋白T（cTnT）等相关基因在分化过程中的动态表达。结果hMSCs诱导前为纺锤形，诱导后第2天部分细胞即开始发生形变，呈球形或短棒状，1w后胞浆中颗粒增多，约20％～30％细胞呈毛刷样变化；hMSCs表面抗原CD31、CD34、CD45在诱导前后差异无统计学意义，CD90未诱导时表达呈弱阳性，诱导后明显增高（P〈0．05）；ANP和CX43在诱导前无表达，诱导后第2周开始表达且表达随时间逐渐增强，但CX43在诱导后第5周表达量开始降低。β—MHC和CTNT基因分别在诱导后第1周和第4周时表达开始增强。在第6周时均达到高峰，第8周时表达开始衰减。结论hMSCs在体外经纯化、扩增和诱导后可表现心肌样细胞的生物学特性，可为hMSCs临床移植治疗提供可靠、安全的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞诱导分化成骨骼肌细胞研究现状

骨髓间充质干细胞（MSCs）是具有多向分化能力的干细胞，主要分布于结缔组织和组织器官，以骨髓中含量最丰富。在不同的诱导条件下，其有向成骨细胞、成肌细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和基质细胞等中胚层细胞分化的能力。因此，这为治疗心血管疾病、神经系统疾病、肌组织和骨关节疾患提供了一条全新的探索之路。现将MSCs诱导分化成骨骼肌细胞的研究进展作一综述。     

骨髓间充质干细胞体外诱导神经干细胞分化的观察

来源于人胚脑组织的神经干细胞及来源于16岁非造血系统疾病患者的胸骨骨髓间充质干细胞(BMSCs),采用Transwell培养板在体外共同培养(共培养组),观察神经干细胞的形态变化,在共培养第7天用免疫荧光染色检测神经干细胞中神经元细胞特异性标志物特异性烯醇化酶(NSE),并与单纯低糖DMEM培养基培养的神经干细胞(对照组)进行比较.结果显示,共培养组中的NSE阳性细胞达32.7%±11. 5%,而对照组未见NSE阳性细胞,两组相比,P＜0.05.认为BMSCs在体外可诱导神经干细胞分化为神经元.     

胚胎干细胞用于肝组织工程研究的初步评价

目的在生物材料上进行胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESc）的三维培养和肝细胞定向诱导分化,评价其用于构建肝组织工程的可行性。方法胰酶消化生物反应器悬浮旋转培养5天的拟胚体（embryoid bodies,EBs）,将细胞悬液与细胞外基质Matrigel 1∶1混合接种于聚乳酸（poly-L-lactic acid,PLLA）和聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）共聚合三维支架内,用系列诱导剂定向诱导肝细胞分化。镜下动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用HE染色、糖原染色、免疫荧光染色检测组织结构形态、肝细胞功能及其肝细胞标志物白蛋白（ALB）的表达。结果显微镜和扫描电镜见ESc可在聚合支架材料上三维立体状态生长,随培养时间不断增殖,交织成网状。HE染色提示形成了致密的类肝组织样结构。糖原染色和免疫荧光染色结果提示形成的类肝组织表达Alb,并有大量糖原存在。结论可在PLLA/PGA三维支架材料及Matrigel上培养ESc和定向肝细胞诱导分化,长时间培养后可形成类肝样组织。     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞

目的体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨已分化成熟的平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。方法分别用骨髓间质干细胞加平滑肌细胞条件培养液;骨髓间质干细胞与平滑肌细胞分层培养;骨髓间质干细胞EGFP标记后,与平滑肌细胞混合培养。用平滑肌细胞抗体SM-a-Actin、Calponin免疫荧光染色,检测骨髓间质干细胞的分化情况。结果骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见EGFP(绿色)和抗SM-a-Actin、Calponin(红色)的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组,骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

人胎肝非实质间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞

目的体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞(NPMSCs)分化为类肝细胞,对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎肝NPMSCs,在1%基质胶作基质,2.5 mmol/L氮胞苷预处理10～12 h,肝细胞生长因子10μg/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导。用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型。采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平,过碘酸希夫试验进行糖原染色。结果从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好,连续传10代后,每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞。NPMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28 d时,形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%,双核细胞比率5%。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中,有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA,至诱导后期表达下降,而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶-π和肝细胞核因子1α表达逐渐上升。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb,诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb。NPMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多。结论在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)体外定向诱导可否分化为神经元样细胞。方法 Percoll分离液离心分离hMSC，体外扩增，采用两种方法：①含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24小时，甲氧酚(BHA)和二甲亚枫(DMSO)联合诱导6小时；②2-巯基乙醇(2-ME)预诱导24小时，BHA和DMSO诱导6小时。免疫组化检测神经元样细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSC在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示hMSC表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性率分别为99．5％，97．8％，98．8％。采用两种方法诱导hMSC后，胞体收缩，突起伸出，较密的部分神经元拉成网状；免疫组化显示诱导的神经元样细胞能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP。结论 成人骨髓hMSC在体外可以分化为神经元样细胞。     

关于骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导剂研究概况

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能,且在体外容易扩增培养,是一种治疗心梗理想的种子细胞,通过诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞是心血管领域研究的热门话题.本文就目前常用的诱导剂作一概况.     

损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞

目的探索损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为肝细胞的可行性及方法。方法培养注射CCl4所致的损伤小鼠肝脏组织块,收集条件培养液,进行MSCs诱导分化。通过形态学观察、RT-PCR、免疫荧光反应和过碘酸Schiff反应鉴定分化细胞。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化。RT-PCR检测显示：AFP基因第5天开始表达,第10天表达增强,此后表达减弱；细胞角蛋白18和Alb基因第10天开始表达,持续到第20天；第20天检测到酪氨酸氨基转移酶基因表达。免疫荧光反应显示诱导20 d的细胞AFP、细胞角蛋白18、Alb表达阳性,诱导20 d细胞过碘酸Schiff反应呈阳性。结论MSCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可分化为肝细胞。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的观察5-氮胞苷对骨髓间质干细胞(BMMSC)体外向心肌细胞诱导分化的影响.方法分离大鼠BMMSC体外培养,使用终浓度为10 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)对其定向诱导,观察细胞形态学的变化,荧光免疫组织化学方法进行鉴定,电镜观察细胞的超微结构.结果BMMSC体外经5-aza诱导4周,肌钙蛋白及Connexin43表达阳性,电镜下在部分细胞内肌节样结构及细胞间形成缝隙连接.结论BMMSC可以在体外经5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞.     

体外模拟心肌微环境下骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 :探讨粒细胞集落刺激因子 （G CSF）和干细胞因子 （SCF）预处理对骨髓间充质干细胞 （MSCs）向心肌细胞分化的影响。方法 :MSCs均采用全骨髓法提取 ,通过换液传代逐渐纯化细胞 ,取传 4代的MSCs,在共培养前用DAPI标记 ,心肌细胞在培养的第 3d与MSCs共培养。对照组 :未施加任何干预的MSCs与心肌细胞共培养 ;实验组 :联合使用G CSF和SCF对大鼠在体动员 ,提取其MSCs与心肌细胞共培养。共培养前测定心肌细胞的活力 ,在共培养第 3、4、5d用免疫荧光标记肌钙蛋白T ,分析DAPI MSCs向心肌细胞分化的百分率。结果 :在共培养的第3、4、5d ,G CSF和SCF处理的DAPI MSCs的分化率分别为 （1.2 4± 0 .16 ） %、（3.4 6± 0 .2 1） %、（7.2 1± 0 .11） % ,均显著高于对照组的 0、（1.2 7± 0 .13） %、（1.32± 0 .2 5 ） %。结论 ::G CSF和SCF对MSCs具有促分化作用。     

不同诱导条件对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :比较小鼠胚胎干细胞 （ESC）在不同诱导条件下分化为心肌细胞的分化比率。方法 :用鼠胚成纤维细胞（MEF）作为饲养层促进 ESC增殖并抑制其分化 ,用维甲酸 （RA ）、二甲基亚砜 （DMSO）、转化生长因子β1 （TGF-β1 ）、激活素 - A（activin- A）为分化诱导剂 ,采用三步法诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,并比较各组分化比率。结果 :各组实验用的各种诱导剂均能诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,尤以 TGF- β1 （2 ng/m l）、activin- A（2 0 ng/ml）及 2 0 %胎牛血清 （FCS）组成的分化培养基可以使其分化比率高达 88% ,显著高于其它各组 （P<0 .0 1）。结论 :以 MEF饲养层培养 ,TGF- β1 、activin- A作分化诱导剂可作为一种比较简便、稳定、高效的 ESC分化条件。