MRP真核表达载体的构建及其在人膀胱癌中的表达

多药耐受（ＭＤＲ）是导致化疗失败的重要原因。研究表明：ｍｄｒ１／Ｐｇｐ介导的ＭＤＲ是膀胱癌ＭＤＲ的重要机制,但不是唯一机制。新近发现的多药耐受相关蛋白（ＭＲＰ）基因是介导ＭＤＲ的一种肯定机制［１］,我们将ＭＲＰ基因转入膀胱癌细胞,并初步观察了其介导的ＭＤＲ及ＭＲＰ的表达。材料和方法　真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＭＲＰ１的构建：含全长ＭＲＰ１ｃＤＮＡ的载体ＰＪ３Ω／ＭＲＰ１由荷兰癌症研究所的ＭａｒｃｅｌＫｏｏｌ博士赠送。用限制性内切酶ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ完全消化ＰＪ３Ω／ＭＲＰ１和ｐｃＤ…     

重组人附睾特异表达蛋白ESC42及其生物学鉴定

目的:利用基因工程技术合成出人附睾特异表达基因ESC42重组蛋白,为其功能研究提供材料。　方法: 从人附睾cDNA文库扩增出ESC42基因片段,构建原核表达载体,进行克隆、表达、蛋白质纯化及单克隆抗体制备; Western印迹鉴定纯化产物及其单克隆抗体的特异性;基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴 定ESC42蛋白相对分子质量(Mr)和肽质量指纹,用MS Fit软件查询NCBI数据库。　结果:获得rhESC42融合蛋 白纯度为99%;Mr为11978.12,制备出抗rhESC42单克隆抗体;质谱分析的数据覆盖了所预测氨基酸序列的48%, 且符合率为100%。在Expasy数据库中进行结构域扫描,发现ESC42属于β defensin家族,具有抗菌活性。　结 论:获得了高纯度且具有生物效应的rhESC42重组蛋白质,并从蛋白质水平对预测氨基酸序列进行了证实,为以后 的功能研究奠定基础。     

RhoC基因真核表达载体的构建及其表达

目的 为探讨RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供实验模型。方法 用限制性内切酶酶切RhoC基因，定向克隆到pcDNA3.1上，利用脂质体将重组载体（pcDNA3.1-RhoC)空载体（pcDNA3.1)转染入HEPG2细胞，潮霉素选择培养，RT－PCR及免疫组化鉴定其稳定表达。结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1-RhoC在HEPG2细胞中有稳定表达。结论 本实验为深入研究RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供了理想的体外实验模型。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

人TRPC1基因真核表达载体的构建及肝细胞表达

目的 构建人TRPC1基因真核表达载体,并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法 提取细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)得到TRPC1基因的编码序列,经纯化回收后克隆入表达载体pGM-T中,酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,最后转染HL-7702细胞,通过电泳和噻唑蓝(MTY)比色法检测基因表达与细胞生长.结果 扩增片段长度为455 bp,重组质粒pGM-T-TRPC1经酶切鉴定条带位置正确,证明表达载体成功构建.电泳结果显示转染重组质粒后的HL-7702细胞表达TRPC1增强.MTF检测发现转染前后肝细胞生长未受到明显影响(t值分别为0.43、-0.40、-2.01、-1.60、-0.41和-0.72,P值均0.05).结论 成功构建人TRPC1基因的真核表达载体pGM-T-TRPC1,并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

目的 构建睾丸特异表达基因2(TSEG-2)的真核表达载体,探讨TSEG-2在细胞中的表达及其生物学功能.方法 以小鼠睾丸组织cDNA为模版,设计携带HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点的引物序列,聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段,克隆至携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1;在阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd 48 h后,荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长活性,AO/EB荧光染色法、Hoechst 33258荧光染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR测定Fas、bcl-2、bax表达水平.结果 成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP-TSEG2,转染GC-2spd细胞后可见胞质内绿色荧光蛋白表达.转染pEGFP-TSEG2 48 h后,GC-2spd细胞生长抑制39.2%(P＜0.05),出现细胞凋亡形态学改变,凋亡率为28.3%(P＜0.05);GC-2spd细胞中Fas和bcl-2的表达分别下调17.9%、64.8%(P＜0.05),而bax的表达上调25.1%(P＜0.05).结论 成功构建TSEG-2基因的真核表达载体,能在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡.     

EndoA基因真核表达载体构建及其对皮肤表皮细胞的作用

瘢痕组织是人体创伤修复过程中的一种自然产物。然而，胚胎皮肤却具有创伤后无瘢痕愈合的能力。近年来研究发现无瘢痕愈合是胚胎皮肤固有的特性。我们通过构建真核表达载体pcDNA3．1／EndoA,并转染小鼠皮肤表皮细胞，研究EndoA对成鼠皮肤表皮细胞的作用。     

人血管内皮抑素毕赤酵母真核系统的建立

目的构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达系统。方法利用RT-PCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆,测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功,使高效表达ES蛋白成为可能,并为采用抗血管生成方法治疗恶性肿瘤的研究奠定了基础。     

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。     

pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoI和KpnI双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法转染Top10感受态细胞（转染组）,同时设空白对照组（仅转染pEGFP-N3质粒）和未转染组（不予转染）。采用Westernblot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoI和KpnI双酶切后,行1％琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708bp处和4700bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Westernblot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0．6573±0．0325,空白对照组为0．3017±0．0287,未转染组为0．3143±0．0266,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。     

肝癌特异性血管抑制疗法的真核表达载体的构建及其表达

目的构建受甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(Alb)启动子调控的含有血管抑制素(angiostatin)K5序列的真核表达载体,通过基因转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞,观察angiostatinK5的表达。方法用RT-PCR法从正常人真核细胞扩增出angiostatinK5基因,将AFP增强子和Alb启动子调控序列定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1,并将angiostatinK5cDNA置于上述调控序列之下,从而构建得到重组真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His。利用细胞培养、脂质体介导的细胞转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞。利用SDS-PAGE和Westernblot法检测肝癌细胞中angiostatinK5的表达。结果通过酶切鉴定及DNA测序证实目的真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His与预期的结果相同。SDS-PAGE及Westernblot分析证明,angiostatinK5在肝癌细胞中得以表达。结论构建的肝癌特异性重组真核表达载体可增加对AFP阳性肝癌细胞的治疗的特异性,并用于实现对肝癌的特异性血管抑制作用。     

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达.方法 以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中.采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达.结果 PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功.在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达.     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

真核表达载体plRES2EGFP—Cadherin-11的构建及其在BMSCs内的表达

目的构建plRES2EGFP—Cadherin—11真核表达载体,并检测其在BMSCs中的表达情况。方法应用聚合酶链反应技术从人Cadherin-11 cDNA中扩增出Cadherin-11基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切。将其插入用相同酶处理的载体pIRES2EGFP;将重组质粒转染BMSCs,应用Westernblot方法检测其在细胞中的表达情况。结果酶切和测序结果表明,扩增的Cadherin-11基因序列正确,大小为2390bp;Western blot表明,Cadherin-11蛋白在BMSCs中正确表达,大小约88kD。结论Cadherin—11蛋白能在BMSCs中高度表达,可望用于提高BMSCs与支架材料的粘附性。     

人TRAIL基因在COS-7细胞中的表达及在治疗肝细胞癌中的作用

目的　探讨TRAIL以及联合应用亚毒性剂量的化疗药对肝细胞癌的治疗作用。方法　用人TRAIL重组表达质粒pcDNA 3 0 hTRAIL瞬时转染COS 7细胞 ,利用其表达的活性蛋白 ,并联合应用亚毒性剂量的化疗药 ,观察其对于肝癌细胞株 (HepG2、SMMC 772 1)的胞毒作用。　结果瞬时转染COS 7细胞能够表达有活性的人TRAIL蛋白 ,对两种肝癌细胞株均有弱的杀伤作用 ,杀伤率为 9 2 %、9 5 % ;联合应用亚毒性剂量的化疗药丝裂霉素 (M)、5氟尿嘧啶 (5 FU)、放线菌素D(AcD)能够大幅度提高TRAIL的细胞毒活性 ,杀伤率分别为TRAIL +M(6 0 1%、32 6 % ) ,TRAIL +5 FU(6 8 1%、2 9 2 % ) ,TRAIL +AcD(72 9%、5 8 6 % )联合用药前后有显著差异性 (P <0 0 5 )。　结论TRAIL与化疗药物丝裂霉素、5氟尿嘧啶、放线菌素D具有很强的协同杀伤肝癌细胞株的作用 ,对于肝细胞癌的生物治疗具有一定的应用前景。     

多药耐药真核表达载体的构建及其在人肝癌细胞HepG2中表达

目的构建携带多药耐药mdr1全长基因的真核表达载体并研究其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法双酶切质粒pHaMDR1，获取含mdr1全长cDNA片断，将此片段定向克隆到真核表达载体PCI-neo多克隆位点。经脂质体法转染HepG2细胞。G418筛选稳定的细胞系HepG2／mdr1，PCR检测mdr1特异片段，RT-PCR检测HepG2／mdr1细胞mdr1mRNA表达。流式细胞仪检测HepG2／mdr1细胞P-gp的含量。结果成功构建携带mdr1全长基因的真核表达载体，并在HepG2细胞中表达，形成稳定的细胞系HepG2／mdr1。其mdr1mRNA及P-gp的含量较未转染该载体的HepG2细胞显著增加。结论用真核表达载体将mdr1全长基因导人人肝癌细胞HepG2能够建立高效、稳定的多药耐药细胞系，为进一步研究多药耐药机理提供理想的细胞模型。