PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V(16)A多态性的实验条件研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件．方法：对影响MnSOD基因PCR反应以及用限制性内切酶BsawI切割主要因素进行了系统研究．结果：最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15止体系中加8pL产物用2U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP方法检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的实验研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测CCR5基因启动子区59029G／A多态性的最适实验条件．方法：对主要影响因素设系列浓度梯度分别进行PCR后观察电泳结果。结果：最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．4μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以1．0U为最适Taq酶量．结论：酶切体系为20μL体系中加5μL产物用4U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C/G多态性的实验研究

目的为研究PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的最适实验条件．方法对主要影响因素设系列浓度梯度进行PCR后观察电泳结果，设置不同的体系对RFLP方法进行了研究．结果最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．6μmol／L；最经济有效的酶切体系为12μL体系中加4μL产物用3U的酶消化．结论最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．     

PCR-RFLP技术检测SUMO4基因163A/G多态性的实验条件研究

目的确定PCR-RFLP技术检测小泛素样修饰蛋白4（SUMO4）163A/G多态性的最适实验条件.方法对影响SUMO4基因PCR反应的主要因素设定系列浓度梯度分别进行研究.结果最适变性温度为94℃;最适退火温度为55℃;最适引物浓度为0.25μmol/L;最适Mg2＋浓度为1.5mmol/L;最适dNTP浓度为0.25mmol/L;以2.5U为最适Taq酶量;酶切体系为31μL体系中加10μL产物用10U的酶消化.结论最佳实验条件的摸索是进行糖尿病实验研究的关键.     

PCR-RFLP法检测葡萄糖激酶基因启动子-30位点变异的实验条件研究

目的：确定PCR扩增葡萄糖激酶基因启动子区以及用Alw21I内切酶切割-30位点的最佳实验条件。方法：对影响PCR反应以及酶切的实验因素进行系统研究。结果：最佳引物浓度为0．3μmol／L；以1 U酶量效果最满意；最适dNTP浓度为167μ mol／L；最适镁离子浓度为1．5mmol／L。20μL的酶切体系中，最佳酶切产物为5μL，最佳内切酶量为5 U，酶切时间应超过9h。以上参数偏离最适条件将会导致实验失败。     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．     

固定化E.coliBL21（pTc—gsh）细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coliBL21（pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽（GSH）。从酶活收率及机械强度方面进行比较，选择卡拉胶为包埋载体，其最适PH为7.0，最适温度为40℃。相关物质对GSH的合成均有影响：半胱氨酸、甘氨酸的最达浓度为20mmol/L，谷氨酸的最适浓度为60mmol/L；Mg^2 /ATP为1-5（V/V）较合适；腺苷二磷酸（ADP）浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%。优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L，操作稳定性较好；延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%；与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24g/L，收率比直接加入ATP提高24.2%。     

国外实验动物信息资源网站

目的建立实验兔随机扩增多态DNA（RAPD）的最优反应体系,并对RAPD引物进行筛选优化。方法以白毛黑眼（WHBE）兔,日本大耳白（JW）兔,新西兰（NZW）兔为实验材料,对影响RAPD反应的各因素进行优化,摸索出最佳的Mg^2＋,dNTP,Taq酶,引物和DNA模板的浓度,并从60个随机引物中筛选出适合实验兔RAPD反应的引物。结果最优RAPD—PCR反应体系为：在20山的反应体系中,Mg^2＋1．5mmol／L,dNTP0．25mmol／L,Taq酶1．25U,引物5μmol／L,模板DNA40ng。60个RAPD引物中剔除了重复性差,条带模糊的引物后,有25个引物稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。结论本研究筛选出的25个引物和建立的PCR体系可应用于实验兔的RAPD反应。     

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2 浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

香加皮ISSR—PCR条件体系的优化

采用正交设计法、均匀设计法,对影响香加皮IssR—PCR43体系的引物、Mg2＋、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度进行优化,通过两种方法的比较建立了适合香加皮ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,含Mg2＋1mmol／L、dNTP0．15mmol／L、引物1．0μmol／L、TaqDNA聚合酶1U、buffer2．5μL和模板DNA约50ng。在此基础上对扩增程序中的退火温度进行筛选,通过比较将退火温度定为50℃,最终扩增程序定为：94℃预变性4min接着进行40个循环：94℃变性30S,50~C退火1min,72℃2延伸90s;循环结束后72℃延伸10min。     

高效毛细管区带电泳法检测血中利多卡因浓度

为建立高效毛细管区带电泳（CZE）法检测血中利多卡因浓度的方法，正交设计法选择分离条件。500μL健康人血清加2mol／L的NaOH100μL乙醚5mL，振荡1min，3000r／min离心10min，取上清6℃氮气吹干，残余物加1mmol／L HCl250μL溶解后进样测定。电泳分离条件：20mmol／L柠檬酸盐缓冲液（pH=4．8）。压力（0．5psi）进水5s，电动进样（8kV，8s），UV检测器，检测波长200nm，运行电压25kV，实验温度25℃。结果，在0．1～10mg／L范围内呈良好的线性关系（R^2=0．9966，n=7）。回收率为89．9％～103．9％，日内及日间精密度（1LSD）均小于10．3％。方法的检测限为10ng/mL。认为本方法简便、快速、灵敏，为利多卡因的定量测定提供了新的、更为理想的方法学手段。     

人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

目的建立PCR—RAPD反应体系，提升细粒棘球蚴随机扩增多态性DNA（RAPD）遗传多态性研究的稳定性，为研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。方法采用改进的酚-氯仿抽提法提取细粒棘球蚴基因组DNA，用单因素筛选方法建立PCR—RAPD分析体系。结果采用改进的酚／氯仿抽提方法提取细粒棘球蚴基因组DNA质量高，适用于PCR—RAPD扩增分析；在25μL体系中，RAPD—PCR扩增反应各成分的最佳浓度为：dNTP0．2—0．3mmol／L、Taq酶2．5U、随机引物0．8—1．4μmol／L，模板为60ng。PCR扩增最佳条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s、32℃退火45s、72℃延伸1min、共35个循环；最后72℃延伸10min；初步从20条引物中筛选出11条带型丰富的随机引物。结论酚-氯仿适用于提取细粒棘球蚴基因组DNA，优化的RAPD反应体系和筛选出的随机引物适合进行细粒棘球蚴RAPD遗传多态性分析。     

人肝谷胱甘肽过氧化物酶的动力学性质

从人肝中分离获得谷胱甘肽过氧化物酶，其最适pH为8．5，最适温度为37℃。该酶以H2O2或GSH为鹿物时表观Km值分别为0．27mmol／L和1．3mmol／L。酶与多分子鹿物作用的动力学研究表明人肝谷胱甘肽过氧化物酶的作用为乒乓机制。并观察了一些金属离子和烷化剂对该酶具有不同程度的抑制作用。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

葡萄糖激酶基因启动子-30位点PCR扩增的实验条件研究

为确定PCR(聚合酶链反应)扩增葡萄耱激酶基因启动子区,对影响PCR的实验因素进行了系统研究.研究结果 表明:最佳引物浓度为0.3μmol/L;以1U酶量效果最满意;最适dNTP浓度为167μmol/L;最适Hg2+浓度为1.5mmol/L.以上参数偏离最适条件将会导致实验失败.     

凋亡相关基因bcl-2和Bax在大鼠应激性溃疡中的表达及作用

目的筛选优化小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法以2条引物对4个品系的小鼠基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD-PCR,分析比较扩增结果。结果扩增结果较好的反应体系及扩增程序如下:在25 ml的反应体系中含有10×buffer2．5μl,dNTP 200 mmol／L,Mg2+ 2．5mmol／L,引物0．2 mmol/L,Taq酶1．25 U,扩增程序为94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸90 s,40个循环后72℃延伸5 min。结论这一反应体系和扩增程序在我们实验室得到了较好的扩增效果。     

应用NCCLS文件对Beckman CX9全自动生化分析仪的精密度进行研究

目的对已使用了5年的Beckman CX9全自动生化仪进行精密度评价。方法通过测定K^＋、ALT、ALB、TG的含量，评价其批内精密度（Swr）、总精密度（SD。结果 K^＋、ALT、ALB、TG高低浓度的Swr分别为0．23mmol／L、0.10mmol/L;1．821U／L、0．90IU／L；1．94g／L、1．31g／；0．05mmol／L、0．02mmol/L；ST分别为0．26mmol／L、0.12mmol／L；1．62IU／L、1．28IU／L；1．77g／L、1．23g／L；0．08mmol／L、0．03mmol／L；一检验x^2〈x^2（95％）P〉0．05。结论该仪器使用5年后精密度依然良好。     

溶菌酶降解壳聚糖条件的研究

研究了溶茵酶对壳聚糖的降解条件，结果表明：脱乙酰度约70％的壳聚糖较易被溶菌酶水解；水解反应的最适温度为55℃、pH值为4．0，低速摇床振荡对水解有利；在壳聚糖水解初期，溶液中还原糖浓度迅速增加，0．5h后水解速率逐渐减慢，至8h后还原糖浓度的增加已很缓慢；酶解液中还原糖的生成量瞳壳聚糖及溶茵酶浓度的增加而增大，当壳聚糖溶液浓度为20mg／mL、溶茵酶浓度为2．48mg／mL时，水解6h后，还原糖的含量可达6．758mmol／L。水解6h后酶解液中还原糖浓度与壳聚糖的浓度呈线性关系。     

循环酶法测定血浆同型半胱氨酸的方法学评价

目的：评价测定血浆同型半胱氨酸（HCY）的循环酶方法。方法：血浆氧化型同型半胱氨酸经三-乙-羧乙基膦（TCEP）还原成游离型HCY，基于HCY甲基转移酶（HMTase），S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHase）构成的循环酶体系以及脱氢酶-辅酶体系的原理，用自动生化分析仪测定血浆HCY。结果：测定线性范围达1．5μmol／L～50．0μmol／L：批内CV分别为2．1％、1．7％；日间CV分别为3．7％、4．1％，总CV分别为4．9％、5．2％；回收率96．8％-101．3％；本法和高效液相色谱法比较：R^2=0．9737，Y=0．972X＋1．595。t=2．01，P〉0．05，差异无显著性；血氨〈50．0μmol／L，三酰甘油〈11．0mmol／L，抗坏血酸〈10．0mmol／L，胆红素〈500．0μmol／L，血红蛋白〈2．0g／L，谷胱甘肽〈0．05mmol／L时，对结果无明显干扰。结论：本方法具有简便、灵敏等特点，适合血浆HCY的常规和自动化分析。