构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒

目的：构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。方法：人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实。将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染HEK293细胞，重组产生复制缺陷型腺病毒。结果：获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。结论：基于Cre重组酶／loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控下活性半胱氨酸蛋白酶-3治疗人卵巢癌

目的构建人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTp）调控下的活性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）重组腺病毒载体并检测其对人卵巢癌的治疗作用。方法构建表达hTERTp调控下活性caspase-3的重组腺病毒载体AdHT-rev-casp3;以CMV启动子调控下活性caspase-3的重组腺病毒载体Ad-rev-casp3为对照,分别应用Western印迹、细胞计数试剂盒（CCK-8）法、流式细胞术和TUNEL检测AdHT-rev-casp3作用后卵巢癌细胞系AO及正常人脐静脉内皮细胞HUVEC中活性caspae-3蛋白p17和聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）裂解片段p85的表达水平、细胞存活率和凋亡率;建立裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型,Western印迹检测AdHT-rev-casp3作用后裸鼠肿瘤及肝脏组织中活性caspase-3的表达情况,观测作用前后裸鼠生存率及肿瘤体积的变化以及裸鼠体内肝酶ALT和AST水平。结果AO细胞在AdHT-rev-casp3（MOI=70）感染后明显表达活性caspase-3蛋白p17和PARP的裂解片段p85蛋白,细胞存活率为55％,凋亡率为26％,而HUVEC在AdHT-rev-casp3感染后无明显p17和pS5表达,细胞存活率和凋亡率与阴性对照组差异无统计学意义;AdHT-rev—casp3作用后的裸鼠肿瘤组织中明显表达活性caspase-3,而肝脏组织中则无表达;AdHT—rev-casp3能明显延长荷瘤裸鼠的生存期[（177±12）dvs（106±11）d],抑瘤率为60％,其作用后裸鼠体内的肝酶水平无明显增高。结论hTERTp系统调控下rev-caspase-3的重组腺病毒AdHT-rev—casp3同时具有较强的致细胞凋亡能力和肿瘤靶向性,能明显抑制卵巢癌移植瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存期,并明显降低revcaspase-3对肝脏的毒性作用。     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体。方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A,E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(GreenFluorescenceProtein,GFP)。采用一系列分子生物学方法构建pShuttle-GFPSV55K穿梭质粒,应用此穿梭质粒与AdEasy-1腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得Ad-GFPSV55K重组腺病毒。PCR法鉴定重组腺病毒,噬斑形成实验测病毒滴度。结果经过酶切鉴定成功地构建了分别携带GM-CSF基因和GFP报告基因的腺病毒载体,病毒滴度为7×1010pfu/ml。结论成功获得由hTERT启动子驱动的条件复制型腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗打下良好的基础。     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建hTERT启动子调控的TRAIL基因载体，探讨hTERT启动子调控的转基因表达。方法：PCR法扩增膜结合型TRAIL基因，回收产物与带有hTERT启动子的载体连接，构建重组载体ph—TERT—TRAIL；瞬时转染乳腺癌细胞系MCF-7／ADR；采用RT—PCR法检测外源基因TRAILmRNA水平的表达，流式细胞术(FCM)检测蛋白水平的表达。结果：重组载体phTERT—TRAIL经PCR、酶切出现相应长度的片段；测序结果连入TRAIL基因；目的基因的序列分析结果与Genebank中的数据高度同源；RT—PCR显示细胞中外源基因TRAIL在mRNA水平明显表达；FCM显示转染了重组载体phTERT—TRAIL的细胞较未转染带有TRAIL基因载体的细胞TRAIL蛋白表达水平上调。结论：成功构建重组载体ph—TERT-TRAIL，hTERT启动子调控的TRAIL基因在乳腺癌细胞系MCF-7／ADR中明显表达。     

hTERT启动子调控的PUMA腺病毒转染卵巢癌COC1细胞的研究

目的：探讨卵巢癌COC1细胞中大量表达p53正向凋亡调控因子（PUMA）在抑制COC1细胞中的作用。方法采用人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的PUMA基因腺病毒载体（Ad-hTERT-PUMA）转染卵巢癌COC1细胞,通过细胞活性检测试剂盒和凋亡试剂盒研究COC1细胞的生长情况,同时分析表达PUMA的水平。结果转染Ad-hTERT-PUMA后,PU-MA大量表达,抑制COC1细胞生长,促进细胞凋亡。结论Ad-hTERT-PUMA成功转染卵巢癌COC1细胞并大量表达,起到了抑制卵巢癌细胞增长的作用。     

一个新的人NFBD1启动子的鉴定与分析

目的：鉴定分析NFBD1启动子,为进一步研究其转录调控奠定基础．方法：综合应用生物信息学分析和异构体特异性的巢式RT—PCR技术鉴定NFBD1转录起始位点和转录变异体;高保真PCR方法扩增NFBD1基因启动子区域并分别定向克隆入pGL3-basic和pGL3-enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体;荧光素酶分析检测启动子活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点．结果：鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,构建了2个含有长度分别为2．5和1．2kb的NFBD1启动子序列的荧光素酶报告基因重组体以及2个相应的含有外源增强子的NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体．启动子活性分析表明,该启动子区域具有启动子活性,且能被外源增强子有效驱动,是一个新的人NFBD1启动子．转录因子结合位点预测分析表明,该启动子区域缺乏典型的CCAAT盒和GC盒,但含有TATA盒以及STAT1,MZF1和MAZ等潜在的转录因子结合位点．结论：鉴定了一个新的NFBD1启动子．     

ID4基因启动子克隆及表达调控载体的构建

目的深入研究ID4基因的表达调控机制。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列,设计PCR扩增引物,采用分段扩增法,从健康人外周血中扩增获得2条长度分别为1829bp和784bp的产物片段,插入用于表达调控研究的pGL3Basic荧光素酶报告载体,实现连接,经测序鉴定。以此为基础进行亚克隆,分别获得5条5′端不等、3′端平齐的片段,插入pGL3Basic载体。结果获得了6条长度依次差别约为400bp的ID4启动子克隆,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体。结论成功克隆了人ID4基因启动子并构建了表达调控载体,为研究ID4启动子活性及表达调控奠定了基础。     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

目的 应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法 以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含Hind Ⅲ/Bam HⅠ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用Hind Ⅲ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD。经PmeⅠ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD。经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10)。包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×10¹² CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符。在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降。结论 应用AdEasier-1系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

OBJECTIVE: To efficiently construct a recombinant adenovirus containing cytosine deaminase (CD) gene driven by vascular endothelial growth factor (VEGF) promoter using an AdEasier-1 system and observe its killing effect on LoVo cells in vitro. METHODS: The CD gene was amplified by PCR, and amplicons were cloned in JM109 bacteria, and then recombined into pREP8 to obtain pREP8-CD, which was then digested by HindIIIand XbaIfor the CD fragment with polyadenylation site (CD-pA) subcloned into the VEGFP -containing shuttle plasmid pAdtrack-VEGFP to generate pAdtrack-VEGFP-CD-pA. After linearization with PmeI, pAdtrack-VEGFP-CD-pA was transformed into AdEasier-1 cells, and the transformants were selected on LB agar plates containing 25 microg/ml kanamycin followed by identification of the positive pAdEasy-VEGFP-CD with electrophoretic analysis and enzymatic digestion. pAdEasy-VEGFP-CD was then digested with PacIand transfected into 293 cells to produce the recombinant adenovirus Ad-VEGFP-CD, which was finally confirmed by PCR. The positive recombinant adenoviruses were transfected into LoVo cells to observe their in vitro anti-tumor effect. RESULTS: pAdEasy-VEGFP-CD was constructed with a success rate of 70%. After being packaged in 293 cells and purified by CsCl banding, the titer of the recombinant adenovirus Ad-VEGFP-CD reached as high as 4.8x10(12) CFU particle/ml, and the adenovirus was further confirmed by PCR analysis. In the presence of the prodrug 5-FC, the recombinant adenoviruses remarkably inhibited the growth of LoVo cells. CONCLUSION: The recombinant adenoviruses containing CD gene under the control of VEGF promoter can be efficiently generated using the AdEasier-1 system, and exhibit potent anti-tumor effect in vitro.     

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。