一种可用于PCR和RAPD分析的基因组DNA单管快速提取法

PCR技术是一种非常有用的遗传操作技术，但它在群体分析中常常因从大量样品中提取基因组DNA的繁重劳动而受限制．理想的DNA提取方法应该可以应用于各种组织，减少处理时的工作量和提取费用，尽量缩减用于分析的组织样品量，并且不应产生对环境有害的废弃物。我们发现了一种新的组织DNA单将快速提取法．提取的DNA经大量稀释后仍能用于PCR反应。这种方法不需要离心，每天可提取6000个样品，每个样品中提取的DNA可完成4000次PCR扩增，而且这种方法可广泛用于提取动物、植物和微生物中的DNA．这种快速提取法包括两个步骤：DNA样品的…     

免提核酸的高通量DNA检测技术

目的介绍一种基于捕获的高通量DNA检测技术,无需核酸提取,适用于不同样品的各种应用,以提供遗传分析有力的技术手段。方法全血、唾液、干血斑和口腔拭子等样品裂解后释放DNA,经热变性后,通过与一系列特异探针杂交使靶DNA被捕获至96孔板;洗去未结合探针后,直接利用特异性引物进行荧光定量扩增(qPCR),或用酶连接连续排列的杂交探针,形成两端为特定序列的单链DNA模板,最后用通用引物进行qPCR分析;以全血中P16基因为靶标评估免提核酸技术的DNA检测效果,并将其应用于全血、血清及干血片样品中寄生虫DNA的检测,评估其灵敏度和特异性,同时评估了不同储藏方法下唾液及口腔拭子DNA检测的稳定性。结果成功应用于全血、干血斑、唾液、口腔拭子等多种样品的DNA检测;无需核酸提取,唾液及拭子样品在室温及4℃下保存15 d后检测仍具有较高的稳定性;该方法对疟原虫的检测下限低至0.06个疟原虫/μL,较传统镜检具有更高的灵敏度,可准确检测到被感染样品中的寄生虫DNA。结论建立了无需核酸提取的高通量DNA检测技术,适用于不同样本类型及靶标检测,为大规模基因筛查分析提供一个灵敏、高效的工具。     

改进的从全血中直接进行PCR扩增的方法

许多PCR诊断性检测都是以血液作为生物性材料。从血液中提取DNA一般采用苯酚/氯仿方法。可是这样既耗时又容易导致提取过程中的DNA污染。为了解次上述问题,一种替代方法直接从血液样品中扩增靶DNA的方法问世。以前的研究者报导能够进行扩增的最小体积有2μl和8μl,而当超过上述体积时都将抑制PCR反应。但作者认为,当血液样品靶DNA的含量很少时,增加血液样品的体积可提高反应的灵敏度。作者介绍了一种简单、有效的方法可以从较大体积的全血样品(约45μl)中进行PCR扩增。在100μl反应体系中可直接对45μl的全血进行     

生物样本库中血液样本microRNA和DNA的检测方法学探讨

目的探讨建立南京医科大学第一附属医院生物样本库中血液生物样本microRNA的检测方法以及血凝块中DNA的鉴定方法。方法随机选取本院生物样本库自2012-2014年存储的胃癌、肝癌血浆标本进行microRNA的提取,后经Q-PCR验证miR-21和miR-387的表达情况以及将对应的血凝块样本进行全血样本DNA的提取,通过全自动核酸分析仪鉴定提取的DNA的完整性。结果 Q-PCR结果表明,冻存血浆在保存了1、2、3年后都能检测到相关的microRNA的表达,同时血凝块中提取的DNA,经全自动核酸分析仪鉴定,DNA完整性也较好。结论该方法能够初步验证我院生物样本库中冻存的血样标本中的RNA和DNA的保存质量,血样质量基本能满足后续科研实验的需求。本研究中的血样标本质量鉴定的方法切实、可行,能较准确地反映生物样本库中血样本的质量,为今后我院组织样本的质量控制体系的建立奠定基础。     

石蜡包埋组织DNA提取方法的比较及巢式PCR技术的应用

确定从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织中提取DNA的最佳方法,增强长片段PCR产物的成功扩增率,便于分子生物学与临床医学的有机结合。本文选取正常甲状腺FFPE标本20份,分别应用一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法三种不同的方法提取总DNA,并应用传统PCR法和巢式PCR法对线粒体DNA(mtDNA)的D环区进行扩增。结果酚/氯仿抽提法所得样本DNA的OD260/D280比值最高,为1.703±0.086。一步法、酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取DNA的普通PCR长片段扩增成功率分别为0%、5%和10%,而巢式PCR长片段扩增成功率分别为0%、95%和85%。可见用蛋白酶K消化、酚/氯仿纯化法提取的FFPE组织标本DNA质量可靠,巢式PCR技术是从石蜡标本中扩增长片段DNA的有效方法。     

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

背景：相对于血液标本,口腔拭子标本更利于大规模载脂蛋白E基因多态性分析的研究,但目前对口腔拭子标本基因组DNA的提取尚无统一方法。 目的：探索合适的口腔拭子标本基因组提取方法以分析载脂蛋白E基因的多态性。 方法：收集50例散发性阿尔茨海默病患者口腔拭子标本,每份标本分别应用纳米磁珠法与PicoDNA微量核酸提取试剂盒法提取基因组DNA,对比分析两种方法获得的基因组DNA纯度和浓度,后续进行PCR反应,应用DNA电泳确认有无成功扩增出目的条带,通过DNA测序方法分析载脂蛋白E基因的多态性。 结果与结论：两种方法提取的基因组DNA纯度均较好,纳米磁珠法提取的基因组DNA浓度要高于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法所得浓度(P < 0.05)。两组获取的基因组DNA均可成功进行PCR扩增,但电泳结果示纳米磁珠法扩增的目的条带更清楚。两组PCR产物DNA测序结果一致,载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的比例分别是6%,71%,23%。表明纳米磁珠法相对于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法提取口腔拭子标本基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究。     

应用酚提取法纯化孕妇血浆及血清中胎儿游离DNA

目的：应用酚提取法以提高纯化孕妇血中胎儿DNA的浓度，并应用套式PCR技术确定男性胎儿SRY基因的存在。方法：孕妇血浆和血清5-10ml采自孕龄为7-38周孕1产0的孕妇26名。其中孕男性单胎正常孕妇18名，孕女胎正常孕妇8名。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇抽提，并经冰浴离心，所得DNA应用套式PCR技术确定男性胎儿SRY基因的存在。结果：血浆标本在第1次PCR扩增后有12名出现351bp的阳性一扩增带。其余6名在第2次扩增后出现254bp的阳性扩增带。第1次扩增确定性别的准确率是72.2%，第2次扩增是100%。血肖标本在第1次扩增后有9名出现351bp阳性扩增带，第2次有16名出现254bp阳性扩增带。第1次扩增确定性别的准确率为50%，两次准确率共为88.9%。同时对2例X-连锁遗传病患者（假性肥大性肌营养不良症和无汗性外胚层发育不良症的患者）进行了产前性别判断。结论：单纯应用酚提取的方法也可以纯化孕妇血浆及血清中胎儿游离DNA的浓度，可以应用较大量的孕妇血浆及血清进行DNA提取，以获得较高胎儿DNA的浓度。加用套式PCR使确定胎儿性别的准确率得到提高。提示可用此方法对有X-连锁遗传病家族史的患者进行产前性别判断 。     

粪便不同保存方法对动物基因组DNA提取效果的影响

目的为了探索一种既能使野外采集的粪便样品DNA保存完好,又方便带回实验室用于分子水平研究的粪便保存方法。方法本研究通过将普氏原羚的粪便在野外分别采取60℃干燥后低温保存,75％乙醇保存,100％乙醇保存,直接低温(保温箱中加生物冰袋)保存,在1个月内、5个月后、8个月后对粪便DNA进行抽提,并将提取的DNA作为模板进行PCR扩增,基因克隆测序。结果短期内均可得到高质量的DNA,DNA大小在23kb左右,电泳带型整齐,无降解,线粒体的扩增结果也完全一致,而用100％乙醇保存粪便DNA的时间更为长久。结论不同的保存方法提取动物基因组效果不一样。     

线粒体DNA提取方法的比较

目的将提取线粒体 DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较 ,以得到最方便快速提取线粒体 DNA的方法。方法分离 Wistar大鼠小肠上皮细胞 ,用 3种方法提取线粒体 DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体 ATPase 8亚基基因 PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体 DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体 DNA量最多 ,Triton法最少。 OD2 6 0 / OD2 80均在 1.78～ 1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体 DNA用于PCR扩增 ,测定出了线粒体 DNA ATPase 8亚基基因序列。结论改进高盐沉淀法提取线粒体 DNA具有操作简单 ,产量多的优点 ,该法所提取 mt DNA可用于 mt DNA测序     

一种碘化钾提取外周血基因组DNA的方法

目的　建立外周血基因组DNA 的快速提取方法。方法　用碘化钾直接从外周血中提取基因组DNA。结果　用该方法提取的DNA 为大分子量DNA;A260/A280为1.85,A260/A230为2.2;提取效率大于90% ;DNA 体外扩增结果良好。结论　该方法简便、快速、经济,可用于大量临床标本的研究。     

Chelex100法提取的口腔黏膜细胞DNA在STR分析中的研究

目的探讨Chelex100法提取口腔黏膜细胞DNA在STR分析中应用的可靠性。方法优化采集口腔黏膜细胞,Chelex100法提取DNA,检测OD260/OD280比值及浓度,以DNA为模板,荧光标记法进行PCR扩增,基因分析仪上电泳,E-seq分析软件进行基因型分析。结果 Chelex100法提取口腔黏膜细胞DNA,OD260/OD280比值:1.397±0.0062(1.23~1.52),浓度:63.039±3.116 ng/μL(26.7~315.9ng/μL),PCR扩增电泳无非特异性带,在Li-COR 4300基因分析仪上电泳,E-seq分析软件进行基因型分析,满足了STR基因型分析研究。结论优化采集口腔黏膜细胞及DNA提取方法,具有快速、简便、经济特点,其提取到DNA的纯度及产量,通过对STR基因型分析结果验证本研究样本DNA是可靠的。     

改进TRIZOL法提取基因组DNA

目的建立一种在提取总RNA的同时又能制备基因组DNA的方法。方法利用TR IZOL法收集水相沉淀总RNA后余下的中间层和有机相,合并去除蛋白质,再提取基因组DNA。通过紫外分光光度法和电泳法予以鉴定,并以之为模板进行PCR扩增鉴定。结果提取的基因组DNA纯度和浓度俱佳,用于PCR扩增效果良好。结论改进的TR IZOL法可以更加充分地利用实验材料,且可靠易行。     

从小量样品中同时提取高分子量DNA和RNA

基本原理 目前,提取DNA和RNA的方法有多种,但多为分别提取而不能由同一样品同时提取。常使需要同时研究同一样品中DNA和RNA的工作既浪费样品,又增加了操作步骤,耗物耗时,还易使所得之DNA和RNA产生一定程度的相互污染。特别在样品的来源有限或样品量少的情况下,用分别提取的方法来获得高分子量的DNA和RNA常顾此失彼,不能同时得到足够     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

石蜡包埋胃癌组织中DNA四种提取方法的探讨

目的探讨提取石蜡包埋胃癌组织中DNA的最佳方法。方法用蛋白酶K消化氯化钠盐析方法、蛋白酶K消化酚氯仿抽提方法、试剂盒方法及改良试剂盒方法,提取石蜡包埋胃癌组织中DNA,进行PCR扩增,应用凝胶电泳成像检出率(检出率=检出数/总例数)比较4种方法提取DNA质量的情况。结果改良试剂盒方法,凝胶电泳成像检出率95.5%(151/158),分别与蛋白酶K消化氯化钠盐析方法15.3%(4/26)、蛋白酶K消化酚氯仿抽提方法8.3%(1/12)、试剂盒方法19.2%(11/57)凝胶电泳成像检出率比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 4种提取DNA方法中改良试剂盒方法,是提取石蜡包埋胃癌组织中DNA的最佳方法。     

正交试验优化实现毛细管中的快速高效DNA提取

目的利用正交试验优化毛细管DNA提取的实验条件,并对优化后的毛细管DNA提取法进行考察。方法结合液滴与磁珠控制方法,在聚四氟乙烯毛细管中依次完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程,建立毛细管DNA提取法。对照方法采用传统煮沸裂解法。采用正交试验考察血液乙型肝炎病毒（HBVDNA）提取的实验条件,包括结合时间、洗脱时间与洗脱温度等对DNA提取效果的影响。考察毛细管DNA提取法的DNA提取效果与重现性,分析提取的DNA定量（Ct值）与原始样品浓度的相关性。比较毛细管DNA提取法与对照方法提取DNA定量结果及耗时。结果正交试验提示毛细管DNA提取法的最佳实验条件为磁珠DNA结合时间5min,洗脱温度60℃,洗脱时间1min。荧光定量PCR显示,毛细管DNA提取法DNA提取效果较好,回收DNA定量具有良好的重现性,提取的DNA定量与原始样品浓度呈正相关（r=0．9999,P〈0．01）。配对t检验显示,毛细管DNA提取法的回收DNA定量显著高于对照方法（t=-4．263,P〈0．001）。采用优化的实验条件,整个毛细管DNA提取操作在23min内完成,而对照方法耗时45min以上。结论利用正交试验实现了毛细管DNA提取实验参数的优化,建立了一种快速、高效的DNA提取方法。     

一种从石蜡包埋组织中快速提取DNA的方法

目的建立从甲醛固定石蜡包埋组织中高效、快速提取基因组DNA的方法。方法将一片10μm厚石蜡包埋大肠癌组织切片直接浸入150μl消化液中,56℃孵育0.5h、1h和2h,灭活蛋白酶K后离心取上清即为DNA提取物。琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的片段分布,紫外分光光度法测定DNA的产量及纯度。以提取的DNA为模板,PCR扩增不同长度产物片段并进行产物的直接测序以评价提取方法。结果该提取方法能够获得较长片段的基因组DNA,从一片10μm厚石蜡切片中即可获得大约60μg的DNA,在0.5h消化条件下获取的模板DNA,即可实现对152bp、293bp、392bp和541bp等4种不同片段的100%扩增,1h消化组的PCR产物可直接用于DNA测序。结论建立了一种简单、快速地从甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法,只需一步消化即可获得满足普通PCR及测序需要的基因组DNA。     

粪便不同保存方法对动物基因组DNA

为了探索一种既能使野外采集的粪便样品DNA保存完好，又方便带回实验室用于分子水平研究的粪便保存方法。本研究通过将普氏原羚的粪便在野外分别采取60℃干燥后低温保存，75%乙醇保存，100%乙醇保存，直接低温（保温箱中加生物冰袋）保存，在1个月内、5个月后、8个月后对粪便DNA进行抽提，并将提取的DNA作为模板进行PCR扩增，基因克隆测序。结果表明，短期内都均可得到高质量的DNA，DNA大小在23 Kb左右，电泳带型整齐，无降解，线粒体的扩增结果也完全一致，而用100％ 乙醇保存粪便DNA的时间更为长久。     

石蜡包埋组织提取DNA不同条件下的PCR扩增

背景：在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中会对DNA造成损害,提取的DNA在用于PCR扩增时部分结果并不理想。 目的：比较分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。 方法：从10.0 μm×2、10.0 μm×4和10.0 μm×5石蜡包埋食管癌组织切片中提取DNA,以0.05,0.1,0.2 μg模板DNA量扩增内参基因β-actin,PCR反应循环次数分别为35,40,45次,分析影响PCR反应的因素。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳结果显示以10.0 μm×2组织切片量,PCR反应循环次数40次,PCR反应模板DNA量      0.05 μg扩增取得的目的基因DNA的质量最高。说明减少石蜡包埋组织用量和减少模板DNA量有助于获得高质量的PCR反应条带,且PCR反应循环次数应大于40次,小于45次,再增加循环次数,则意义不大。 关键词：石蜡包埋组织;提取DNA;PCR反应;循环次数;模板DNA doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.017     

微量血提取DNA法在PPARγ基因突变研究中的应用

目的建立一种大样本外周血基因组DNA的提取方法.方法改良经典基因组DNA提取方法,用TritonX-100和Tris-HCl混合溶解红细胞.结果用该法提取的DNA,A260nm/A280nm均大于1.89, 含量大约300μg/ml,PCR扩增产物酶切结果良好.结论该方法简便、经济,可用于大样本的基因分析.