sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

细粒棘球蚴延伸因子-1重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)延伸因子(Eg.EF-1)重组蛋白对小鼠的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。方法:ICR小鼠随机分为免疫组和佐剂对照组,每隔2周皮下免疫1次,在第3次免疫后2周,用Eg原头节进行攻击感染,感染后20周剖杀小鼠,检获Eg包囊,计算免疫保护力,并用酶联免疫吸附法测定血清中免疫球蛋白(Ig)G及其亚型和IgE水平。结果:与佐剂对照组比较,免疫组小鼠的免疫保护力为85.6%,血清IgG、IgG1、IgG2a水平显著性升高(P<0.05),IgG2b水平轻微降低(P>0.05),IgG3和IgE水平无明显变化。结论:rEg.EF-1重组蛋白能诱导小鼠产生一定的免疫保护力,是潜在的疫苗候选抗原分子。     

人胰升血糖素样肽1突变体基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 构建人胰升血糖素样肽1(hGLP-1)突变体基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达.方法 用生物合成方法获得hGLP-1突变体基因8Val-hGLP-1,将其克隆于载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/8Val-hGLP-1融合表达载体,转化大肠杆菌BL21,酶切电泳以及测序鉴定阳性克隆,用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法检测其重组蛋白诱导表达情况.结果 重组质粒pGEX-4T-1/8Val-hGLP-1经双酶切电泳鉴定与测序分析证实构建成功,SDS-PAGE与蛋白免疫印迹分析证实其成功诱导表达重组融合蛋白.结论 成功地克隆了hGLP-1突变体基因8Val-hGLP-1,并在大肠杆菌中进行表达,为下一步获得含突变体基因的重组hGLP-1蛋白及其生物学功能研究奠定良好基础.     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇基因在E.coli细胞中的表达

目的：探索在E.coli BL21中表达hTPO抗原决定簇片段（AA568－AA874）。方法：将hTPO抗原决定族基因（1702－2622,编号相对于起始密码子）连接到表达型载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒。然后转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。表达产物采用亲和层析方法纯化,SDS－PAGE法测定其分子质量,ELISA法鉴定免疫学活性,考马斯亮蓝染色法定量。结果：成功地表达了hTPO抗原决定簇基因。纯化的GST－hTPO融合蛋白分子质量为61.4ku,hTPO片段分子质量为37.6ku。以此作为抗原按ELISA法分别与TPOAb阳性血清或阴性血清反应,结果表明,GST－hTPO及hTPO片段均与TOPAb特异性结合。纯化的GST－hTPO产量为10mg/L培养基;hTPO片段产量为1.2mg/L培养基。结论：利用基因工程技术可获得高纯度的GST－hTPO融合蛋白及hTPO片段,产物具有良好的免疫学活性。     

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。     

细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(一)——应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)

目的应用GST基因融合蛋白系统制备核糖体蛋白质S3a(RPS3a)。方法将S3acDNA序列插入到pGEX-4T-2质粒中,制备GST/S3a融合蛋白及其抗体。结果S3acDNA序列在XhoI位点上插入到pGEX-4T-2质粒中,形成重组的pGEX-4T-2/S3a质粒。结论pGEX-4T-2质粒编码GST蛋白基因,在IPTG的诱导下可以表达GST/S3a融合蛋白。为下一步实验奠定了基础。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

胸腺素α1-胸腺五肽在大肠杆菌中的表达及表达条件优化

目的探讨胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大肠杆菌中的表达及表达条件优化。方法将化学合成的Tα1-TP5基因与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coliBL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间等条件对融合蛋白表达量的影响。融合蛋白经GST琼脂糖珠亲和色谱纯化及重组肠激酶切割后,电喷雾质谱鉴定Tα1-TP5。结果选用TB培养基,在菌体对数生长中后期加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG,37℃诱导5 h,GST融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的35.8%,且主要以可溶形式表达。Tα1-TP5的分子质量与理论值相似。结论 Tα1-TP5成功在E.coli中表达,并确定了最佳表达条件。     

血管基膜衍生多功能肽在大肠杆菌中的表达及抗肿瘤活性的测定

目的 构建血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)原核表达载体、诱导表达GST-VBMDMP融合蛋白,观察其对Lewis肺癌自发转移瘤模型的影响。方法 人工合成VB-MDMP DNA序列(人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的两个功能区获得性肽基因序列),构建克隆载体PUC19-VBMDMP,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经测序和酶切分析鉴定获得了未发生移码突变的PGEX-4T-1-VBMDMP融合载体质粒。转化入大肠杆菌后,用 IPTG诱导表达融合蛋白。Glutathione sepharose 4B层析柱纯化蛋白表达产物。采用Lewis肺癌自发转移瘤模型,检测VBMDMP的抗肿瘤作用。结果 成功的构建pUC19-VB-MDMP克隆和pGEX-4T-1-VBMDMP表达载体,在大肠杆菌获得稳定表达,用Glutathione sepharose 4B层析柱获得纯化的GST-VBMDMP融合蛋白。VBMDMP(GST-VBM-DMP 10、6、2 mg·kg~(-1))对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有抑制作用(瘤重抑制率分别为95.5％,80.4％,60.05％)。VBMDMP(GST-VBMDMP 10,6,2 mg·kg~(-1))对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为94.8％,86.4％,73.9％)。结论 VBM-DMP对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有抑制作用。     

Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lymphocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro

AIM: To explore the biofunctions of human B7-H4 generated from prokaryotic system. METHODS: The gene of human B7-H4 extracellular region (IgV-like and IgC-like domains) was obtained by PCR from human cDNA FLJ22418 and then inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-5X-3 expressing glutathione s-transferase (GST) fusion protein. After being identified by restriction enzyme digestion and sequencing, the recombinant vector was transferred into host strain E coli BL21-RIL(DE3). A 47 kDa fusion protein (GST/hB7-H4) was induced by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and purified by standard methods reported in the prokaryotic system. The inhibitory effect of GST/hB7-H4 on proliferation of T cells was observed in vitro by CD3mAb activated T-cell culturing system and [(3)H]-thymidine incorporation assay. The concentrations of interleukin-2 and iterferon-g in the supernatants of T cells were determined by ELISA. RESULTS: We successfully constructed the method for high-level expression and purification of the hB7-H4 extracellular domain as GST fusion protein from E coli. The GST/hB7-H4 fusion protein produced in bacteria had obvious biological activity to inhibit T-lymphocyte proliferation and IL-2 secretion. CONCLUSION: The prokaryote expression system could be used to generate hB7-H4 protein with natural spatial conformations and biological functions, which provided an efficient and economical way for the preparation of this target protein.     

HPV6bL1-TpN15嵌合基因原核表达系统的构建

目的 分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和尖锐湿疣(cA)组织中扩增人乳头瘤病毒(HPV)6b型L1和TpN15基因,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因及其原核表达系统.方法 采用PCR分别从CA组织及Tp临床菌株中扩增HPV6b L1和TpN15基因片段,构建HPV6b L1-TpN15嵌合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b L1-TpN15,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达的融合蛋白用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹法分析鉴定.结果 HPV6b L1-TpN15融合蛋白在原核表达系统中得到了较高表达.结论 原核表达的HPV6bL1-TpN15融合蛋白具较强的抗原性.     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .在实际应用中可根据反应强度来加以区分