结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的 克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法 提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665 bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60 kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83 kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论 成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。     

弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达

目的　体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白1433(Toxo1433)基因编码序列,构建原核表达质粒,并表达Toxo1433。　方法　收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取RNA,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RTPCR扩增Toxo1433基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。　结果　从弓形虫RH株RNA中扩增出803bp的Toxo1433基因片段,构建重组质粒pET28a/1433;IPTG诱导,SDSPAGE显示表达产物的大小约30.7kDa,Western印迹鉴定为Toxo1433。　结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了1433基因,构建了pET28a/Toxo1433重组质粒,并获得高效表达。     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析

目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核杆菌Mtb8.4抗原在大肠杆菌中表达的初步研究

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分析。结果重组质粒pETHisMtb8.4成功构建,含阳性重组子的菌体蛋白经SDSPAGE电泳出现一新的蛋白带,与预计相符。结论初步证明构建的大肠杆菌重组体能够表达目的蛋白,为进一步对其免疫效应的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因的克隆表达研究

目的在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491的蛋白。方法通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv1446c、Rv2145c、Rv2971、Rv0491基因,以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv1446c、rRv2145c、rRv2971、rRv0491在大肠杆菌中的表达。经质谱仪测定重组蛋白的分子量。结果与结论4个重组蛋白成功在大肠杆菌中表达,分子量实测值与理论相近。     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65kD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增,目的基因克隆并转化,重组子经酶切和自动测序鉴定,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kD蛋白。结果 65kD蛋白编码基因约1.6kb,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体,3个测序反应覆盖99.1%目的基因;大肠杆菌表达重组65kD蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。     

结核分支杆菌38 000蛋白质抗原在大肠杆菌中高效表达

目的通过结核分支杆菌３８０００蛋白质抗原编码基因在大肠杆菌中稳定表达,以获得大量纯化的３８０００蛋白质抗原,进而研究其免疫学特性。方法采用ＤＮＡ重组技术构建结核分支杆菌３８０００蛋白质抗原表达载体,双酶切和聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定转化子,阳性重组子转化大肠杆菌,并诱导表达外源蛋白;十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）和免疫印迹法鉴定３８０００蛋白质抗原在大肠杆菌中的表达;对染色的凝胶扫描,以测定目的蛋白质表达水平。诱导的工程菌抽提包涵体,以确定３８０００蛋白质抗原在大肠杆菌中的表达形式。结果菌体蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ,含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带,表达量占菌体总蛋白的３６％～４０％。肺结核患者的血清和结核分支杆菌免疫的羊血清与重组３８０００蛋白质均呈阳性反应。３８０００蛋白质抗原在大肠杆菌中表达方式主要以包涵体形式。结论构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌３８０００蛋白质抗原,包涵体的表达形式有利于蛋白质纯化和蛋白质稳定,蛋白质必须经过正确折叠才具有生物学活性     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv基因glcB的克隆、表达及酶活性的实验研究

目的应用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达有活性的结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB(80.4kDa),为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制提供理论依据。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌的基因glcB(Rv1837c),并与克隆载体PCR4BLUNT-TOPO连接,DNA测序后,经酶切将glcB与表达载体pET23b连接,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达目的蛋白GlcB。IPTG诱导表达,破菌,离心,采用Ni2+亲和层析法纯化上清液中的目的蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的表达及纯度;同时应用抗6个组氨酸的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot),并进行了酶活性的分析。结果PCR产物序列正确,GlcB可在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中高效表达,可溶性好。经SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色及Western blot检测证实,表达的重组蛋白纯度高,与预期的GlcB大小一致,约80kDa。活性分析提示该重组蛋白具有苹果酸合成酶的功能,且酶活性为5.5μmol/(min·mg),与相关的文献报道一致。结论结核分枝杆菌H37Rv分泌蛋白GlcB能够在大肠杆菌中高效表达,且具有酶活性,有望为新一代抗结核药物的研制及结核早期诊断提供依据。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。     

结核杆菌复苏因子基因的克隆、表达及复苏作用的研究

目的研究结核杆菌复苏因子基因的复苏作用。方法PCR扩增结核杆菌复苏因子基因片段并克隆至表达载体pET30a中,IPTG诱导表达复苏因子蛋白,经树脂纯化后进行SDS-PAGE和Western blot分析;按不同浓度和不同组合进行休眠结核菌复苏培养。结果PCR扩增获得结核杆菌复苏因子基因片段,大小分别为1 200、900、500、500和450 bp,与理论值相符。重组质粒转化pET30a菌,IPTG诱导获得有活性的复苏因子蛋白,分子质量单位为36 ku。复苏实验证明,复苏因子蛋白有促结核杆菌复苏和生长作用,以低浓度组合效果最佳。结论结核杆菌复苏因子蛋白对休眠结核杆菌有促复苏作用。