人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VRl012—polβ的构建

目的：构建含有野生型DNA聚合酶β基因的重组表达载体VRl012-polβ。方法：提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VRl012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果：插人片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确。结论：重组野生型DNA聚合酶B表达载体VRl012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具。     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建

目的:构建含有野生型 DNA聚合酶β基因的重组表达载体VR1012-polβ.方法:提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR1012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定.结果:插入片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确.结论:重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具.     

大鼠全长OBRb cDNA克隆及真核表达重组体的构建

目的克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cDNA(OBRb cDNA)及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法应用RT-PCR方法分段扩增全长OBRb cDNA,再将它们连接起来,并获得载有全长OBRb cDNA的阳性克隆质粒.将上述质粒中全长OBRb cDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致.结论成功地克隆了SD大鼠全长OBRb cDNA,并构建了真核表达重组体.     

大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。（２）方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＮ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交欣慰以析细分级，并经聚合酶链式反应鉴定其活性。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的建立稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系。方法将已构建的野生型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株,用免疫印记方法鉴定野生型DNA聚合酶β蛋白水平的表达。结果成功转染和筛选出表达外源性DNA聚合酶β基因的中国仓鼠卵巢细胞株,并检测到该基因蛋白水平的高表达。结论建立稳定表达DNA聚合酶β的细胞株,为进一步研究DNA聚合酶β高表达对细胞生物学特性的影响奠定基础。     

人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

DNA聚合酶β高表达与细胞癌变关系的研究进展

本综合分析了DNA聚合酶β的结构、功能以及其高表达后的分子效应,资料显示DNA聚合酶β高表达可以导致细胞自身突变率增加和遗传不稳定性,且DNA聚合酶β高表达在肿瘤的起始、演进和治疗中有重要的研究价值。     

人肺癌组织中DNA聚合酶β表达及意义

目的:通过检测DNA聚合酶β(DNApolymerasebeta,DNApolβ)基因在人肺癌,人正常肺组织中蛋 白水平的表达情况来探讨其在肺癌发生发展过程中的作用和意义。方法:应用免疫组化的方法对67例肺癌, 27例正常肺组织中DNApolβ进行定位及蛋白表达低下率的比较,建立数据库,采用SPSS10.0软件对数据进 行统计学分析,以揭示DNApolβ蛋白表达与肺癌发生的关系。结果:在肺癌组织中,有50.7%(34/67)的人 DNApolβ表达低下;正常肺组织中,有14.80%(4/27)的人表达低下,二者表达低下率存在显著差异,χ2= 10.31,P<0.05,OR=5.92,95%C.I为(2.00,17.51),提示DNApolβ表达低下是肺癌发生的一个危险因素。 且DNApolβ表达与暴露因素如:肿瘤家族史、性别、吸烟状况有关,吸烟可以抑制其表达。肺鳞癌,细胞癌的 低下率远高于其他组织类型,有依鳞癌、小细胞癌、腺癌和其他类型依次降低的趋势χ2trend=9.36,P=0.02。 DNApolβ蛋白表达与TNM分期、细胞分化程度的高低、有无淋巴结转移、3年生存率没有显著相关。结论: DNApolβ表达在肺癌的发生中起着重要的作用,该基因的表达低下可能是肺癌发生的一个分子标志。     

人食管癌顺铂耐药细胞系DNA聚合酶β的表达

目的:建立人食管癌顺铂(cDDP)耐药细胞系,测定耐药细胞系DNA聚合酶β(polβ)的表达。方法:以临床食管磷癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用cDDP(10mg/L)反复间歇 24h暴露法作用于食管癌细胞系ECa -109,建立cDDP耐药细胞系ECa 109 /cDDP;MTT法测定药物敏感性,倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Westernblot测定细胞内DNApolβ表达水平。结果:与ECa- 109细胞比较,ECa -109 /cD DP细胞形态发生了改变,对cDDP的耐药指数为 1. 56;细胞周期发生了变化,S期细胞增多,G0 /G1 期细胞减少,细胞内DNApolβ表达水平增高(P<0. 05或 0. 01)。结论:ECa-109 /cDDP具有耐药表型,其耐药性产生可能与细胞内DNApolβ表达增高有关。     

食管癌中DNA聚合酶β的突变

目的研究DNA聚合酶β基因在采自食管癌高发区的食管癌标本中的突变情况.方法提取总RNA反转录合成cDNA,经PCR扩增后以SSCP检测其变异情况.结果在食管癌组织标本中存在pol β基因的突变:20例癌组织标本中发现9例突变(45%、9/20),癌旁组织中发现1例突变(5%、1/20).结论在食管癌组织标本中确实存在pol β基因的突变,推测在食管癌的的发生发展过程中pol β基因突变是一个始动因素,是各种致癌因子作用的枢纽,由于该基因的突变可能使得癌基因、抑癌基因如:ras、p53、Rb等的原发性损伤得不到及时正确修复,导致细胞周期的失控、增殖过多,促进恶性转化.     

组织型纤溶酶原激活物cDNA克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活物（t－ＰＡ）cＤＮＡ并构建含t－ＰＡ基因的腺病毒表达 载休划硫氰酸胍；－酚－氢仿一步法从Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞中提取总ＲＮＡ，并经反转录ＰＣＲ获得t－ＰＡcＤＮＡ。将质粒pＵＣ１９双酶切并纯化回收大片段，与纯化后的ＰＣＲ产物连接构成pＵＣ１９t－ＰＡ，转化大肠肝菌ＪＭ１０９，挑选白色克隆作酶切鉴定、测序，pＵＣ１９t－ＰＡ及腺病毒载体pＡdＭＶ（６．６７ｋｂ）分别双酶切前者回收１     

RNA斑点印迹法检测人食管癌DNA聚合酶β的基因表达

目的 :探讨人食管癌组织DNA聚合酶 β(polβ)RNA水平的表达。 方法 :提取 5 1例食管癌患者的手术标本组织 ,包括 :17例癌灶组织 ,17例癌旁组织 ,17例“正常”组织细胞总RNA ,以生物素标记的polβcDNA探针进行RNA斑点印迹。结果 :DNApolβRNA水平的表达癌组织高于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,癌旁组织高于“正常”组织 (P <0 .0 5 ) ,癌组织高于“正常”组织 (P <0 .0 1)。结论 :人食管癌组织及癌旁组织的DNApolβ基因RNA水平表达显著高于“正常”组织 ,提示DNApolβ的过表达可能在食管癌的发生、发展中起 作用。