WT1-反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞的促凋亡作用

应用缺陷型重组腺病毒介导WT1-反义寡核苷酸（ASODN）转染人脑胶质瘤（U251）细胞,逆转录聚合酶链反应检测WT1 mRNA的表达,Western blot检测WT1蛋白的表达;观察转染前后半胱天冬氨酸酶（caspase）3活性的变化及细胞凋亡情况.结果发现WT1-ASODN可使U251细胞中WT1 mRNA和蛋白表达下降;caspase3活性明显增加（P＜0.05）;细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）.     

RNA干扰靶向XIAP对人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为影响

目的 采用RNA干扰技术(RNAi)抑制X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP),观察抑制前后人脑胶质瘤细胞U251的生物学行为.方法 DNA重组技术合成针对人脑胶质瘤U251细胞XIAP基因三条siRNA(siRNA1,siRNA2,siRNA3),以脂质体2000作为载体进行转染,RT-PCR法检测XIAP的mRNA表达,选择特异性较高的siRNA,以此 siRNA为标准建立20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L3个浓度梯度,转染细胞,Western blot 检测XIAP基因的蛋白表达,选出最低有效浓度;流式细胞仪检测抑制前后细胞周期和凋亡率.结果 siRNA成功转染了人脑胶质瘤细胞U251,转染率达到80%以上;RT-PCR检测siRNA2特异性较高;Western-blot检测终浓度为30 nmol/L的siRNA抑制效率较高;流式细胞仪检测停滞在G0/G1期的细胞增多,在S期的细胞减少,并且细胞的凋亡率增加.结论 通过RNA干扰可以抑制人脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达,促进人脑胶质瘤细胞凋亡,从而抑制细胞的生长.     

人参皂甙Rh2对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响及机制探讨

目的观察人参皂甙Rh2（GS-Rh2）对人脑胶质瘤细胞株U251凋亡的影响,并探讨其机制。方法人脑胶质瘤细胞株U251经GS-Rh2处理后,采用MTT法测算细胞抑制率,用流式细胞术测算细胞凋亡率,用RT-PCR检测U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA,用Western blot法检测U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 GS-Rh2对U251具有抑制作用,并呈剂量依赖性;根据细胞增殖抑制曲线计算出GS-Rh2作用于细胞的抑制浓度（IC）,求得IC30、IC50、IC70值分别为10.6、22.3、70.2μg/ml;GS-Rh2可诱导U251凋亡,并呈剂量依赖性。在GS-Rh2作用下,U251中Bcl-2 mRNA、蛋白呈明显低表达,随着GS-Rh2作用时间延长,Caspase-3 mRNA、蛋白表达逐渐增高。结论 GS-Rh2可明显抑制U251增殖,诱导其凋亡,其机制与GS-Rh2下调U251中Bcl-2 mRNA及蛋白表达、上调Caspase-3 mRNA及蛋白表达有关。     

RNAi沉默PTTG基因对恶性胶质瘤U251细胞的影响

目的探讨垂体瘤转化基因（PTTG）siRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞株U251体外增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesi1-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞，通过MTT法观察转染后24h,48h和72h细胞增殖的变化、流式细胞术PI单染观察转染后48h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesi1-2 PTTG siRNA干扰质粒转染U251细胞48h后。PTTG mRNA和蛋白的抑制率分别约为69％和71％；阻滞U251细胞由G1期进入S期，抑制细胞的生长，增加了细胞的凋亡。结论PTTG siRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达，从而调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖。     

短发卡RNA抑制人端粒酶逆转录酶表达对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨短发卡RNA(shRNA)对人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的抑制作用,以及其对人胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响。方法构建针对hTERT的shRNA表达质粒,脂质体介导转染人胶质瘤细胞U251,采用RT-PCR、Western blotting技术检测目的基因的表达,PI-DNA染色、流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡。结果成功构建了hTERT的shRNA表达质粒,其转染U251胶质瘤细胞后,hTERT基因表达明显降低(P<0.05),细胞进入S期出现障碍,停滞在G0/G1期的细胞增多,凋亡细胞增加。结论针对hTERT的shRNA干扰效果明确,其可抑制胶质瘤细胞增殖,促进其凋亡。     

Bcl-2反义寡核苷酸对环已亚胺诱导U251细胞凋亡的影响

目的 探讨Bcl-2反义寡核苷酸对环已亚胺（CHX）诱导胶质瘤细胞U251凋亡的影响。方法在光镜下观察Bcl-2反义寡核苷酸、CHX及二者联合应用对U251凋亡的形态学改变;应用MTT法检测各组U251细胞的抑制率;通过DNA电泳检测CHX诱导U251细胞凋亡的情况。结果 Bcl-2反义寡核苷酸可明显促进CHX诱导的U251凋亡,对照组、SODN组与CHX组、AODN组、SODN＋CHX组及AODN＋CHX组的细胞抑制率相比P均〈0．01,AODN组、SODN＋CHX组和AODN＋CHX组的细胞抑制率相比P均〈0．01;Bcl-2反义寡核苷酸可促进细胞凋亡,呈现出特征性的DNA梯状带。结论Bcl-2反义寡核苷酸和CHX均可诱导胶质瘤细胞U251发生凋亡,且Bcl-2反义寡核苷酸可明显促进CHX诱导的胶质瘤细胞U251凋亡,提高胶质瘤细胞对CHX的敏感性。     

RNA干扰抑制FAK基因表达对人胰腺癌细胞凋亡及吉西他滨敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制黏着斑激酶（FAK）基因表达增强人胰腺癌PANC-1细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对FAK mRNA序列设计合成短发夹状干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-FAK重组表达载体,转染人胰腺癌PANC-1细胞;通过RT-PCR分析其对PANC-1细胞内源性FAK表达的影响;激光共聚焦显微镜检测PANC-1细胞凋亡的形态学改变;用四甲基偶氮唑蓝法观察PANC-1细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变;采用分光光度计检测 Caspase 活性.结果 成功构建 pRNAT-FAK重组质粒,并成功转染PANC-1细胞;RT-PCR证实重组质粒在mRNA显著抑制FAK基因表达（P＜0.01）;吉西他滨组及吉西他滨加pRNAT-FAK组细胞则检测出明显的细胞凋亡;四甲基偶氮唑蓝结果证明在和吉西他滨联合作用下,pRNAT-FAK组PANC-1细胞的生长抑制率明显增高（P＜0.01）;Caspase 3活性明显高于空白对照绀和阴性对照组.结论 pRNAT-FAK可抑制FAK在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,并增强PANC-1细胞对吉西他滨敏感性.     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

βig—h3对人神经胶质瘤U87细胞侵袭力的影响

目的应用转化生长因子β诱导基因克隆3（βig—h3）真核表达载体pEGFP—C2／βig—h3转染人神经胶质瘤U87细胞,观察βig-h3对U87细胞侵袭力的影响。方法重组质粒pEGFP-C2／βig—h3用脂质体转染人神经胶质瘤U87细胞,采用明胶酶谱法和Transwell小室细胞侵袭实验检测转染后细胞基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平和侵袭力的变化。结果与未转染的U87细胞和转染pEGFP—C2空载体的U87／vector相比较,在转染重组质粒pEG-FP-C2／βig-h3的U87／h3细胞中,βig-h3mRNA和蛋白表达均显著增高,U87／h3细胞MMPs表达水平明显提高,细胞侵袭率显著增高（P均〈0．01）。结论βis—h3可促进人神经胶质瘤U87细胞分泌MMPs,从而增强细胞的侵袭力,与神经胶质瘤的侵袭和转移密切相关。     

siRNA下调S100A4基因表达对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨应用小干扰RNA(siRNA)下调人胶质瘤U251细胞中S100A4基因表达和对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法脂质体法U251细胞转染化学合成的针对S100A4基因的特异性siRNA,RT-PCR和Western印迹方法分别检测S100A4 mRNA和蛋白表达水平。分别应用CCK-8法、流式细胞术和酶标仪检测下调S100A4表达对U251细胞增殖、凋亡能力及细胞内含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3活性的影响。结果与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA转染48 h后,siRNA-S100A4组细胞中S100A4 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),U251细胞的增殖受到抑制,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且沉默S100A4表达可以上调caspase-3活性(P<0.01)。结论 S100A4 siRNA能有效下调S100A4基因的表达,抑制U251细胞的增殖,诱导细胞凋亡,参与脑胶质瘤的生物学行为。     

程序性细胞死亡因子4RNA干扰对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响及其调控机制

背景：程序性细胞死亡因子4（PDCD4）是-种新的抑癌基因,在肿瘤的发生、发展、治疗和预后中起重要作用。目的：探讨PDCD4RNA干扰对胃癌细胞株MKN28凋亡的影响及其调控机制。方法：设计PDCD4短发夹RNA（shRNA）干扰序列,构建干扰质粒并转染MKN28细胞,设立阴性对照组和空白对照组。以蛋白质印迹法检测PDCD4和凋亡相关蛋白FLIP、Caspase-8和Cleaved—Caspase-8的表达,以AnnexinV—FITC／PI双染法检测细胞凋亡。结果：PDCD4shRNA干扰质粒转染MKN28细胞后．获得稳定低表达PDCD4的细胞模型,干扰效率为86％。与阴性对照组和空白对照组相比,干扰组PDCD4蛋白表达显著降低（0．11±0．01对0．86±0．18和0．81±0．12．P〈0．01）,MKN28细胞凋亡率亦显著降低（7．13％±0．86％对13．16％±2.35％和12．02％±2．11％,P〈O．05）。与空白对照组相比,干扰组FLIP表达显著增高（1．25±0．34对0．63±0．11,P〈0．01）,而Caspase-8和Cleaved—Caspase-8表达显著降低（0．26±0．08对0．76±0．12,0．11±0．03对0．36±0．09,P〈0．01）。结论：干扰PDCD4表达可抑制胃癌细胞MKN28的凋亡,且这种抑制作用可能是由于干扰PDCD4促进抗凋亡蛋白FLIP的表达,从而抑制Caspase-8的活性引起的。     

GPC-3特异性短发夹型RNA干预基因转录对肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因特异性短发夹型RNA（shRNA）对HepG2细胞增殖的抑制作用。方法设计、合成和筛选GPC-3特异的高抑制率shRNA并构建质粒;观察shRNA沉默GPC-3基因对肝癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建了4种GPC-3 shRNA干扰质粒,以脂质体介导分别转染HepG2细胞后,筛选出的shRNA干扰质粒抑制率最高达89.3%;以该高效GPC-3 shRNA质粒转染HepG2细胞24h、48h和72h后,细胞增殖较对照组分别下降了33.2%、56.0%和71.1%（P〈0.05）,细胞多被阻滞在G1期;HepG2细胞凋亡率达65.6%,显著高于对照组（约为5%,P〈0.05）。结论 GPC-3特异性的shRNA可有效降低HepG2细胞中GPC-3基因转录水平,抑制增殖并促进其凋亡。因此,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

MGMT反义RNA对人脑胶质瘤细胞系U251／BCNU耐药性逆转的研究

为逆转胶质瘤的耐药性，模拟临床亚硝基脲类药物的用药程序，在体外建立由MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系U251／BCNU，并进行细胞耐药性检测和细胞中MGMTmRNA表达的分析；观察MGMT反义RNA对U251／BCNU细胞MGMT表达的调节作用及对U251／BCNU细胞BCNU敏感性的影响。经过5次用药过程，首次在体外成功地建立了对BCNU具有稳定抗性的U251／BCNU，其对BCNU的耐受程度约为U251的17倍；RT－PCR结果显示，U251／BCNU细胞有MGMTmRNA的表达。MGMT反义RNA的表达载体pLaMT5SN和pLaMTSN能够在一定程度上降低U251／BCNU细胞中MGMTmRNA的表达水平，提高其对BCNU的敏感性。认为MGMT反义RNA能够在一定程度上抑制MGTMT的表达水平，提高肿瘤细胞对亚硝基脲类药物的敏感性。     

tBHQ对无机砷诱导HaCaT细胞凋亡中的保护作用

目的观察tBHQ对内源性线粒体凋亡通路和凋亡相关蛋白Bel-2等蛋白表达的影响,探讨tBHQ在无机砷诱导HaCaT细胞凋亡过程中的作用。方法采用分光光度法检测Caspase-3蛋白活力;Westernblot法分析细胞内Caspase-3、CytC、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果NaAsO2单独作用于HaCaT细胞24h,线粒体中CytC蛋白表达降低,而胞浆中CytC蛋白表达则随染砷剂量的增加而明显升高。tBHQ预处理12h后再分别暴露于NaAsO2,线粒体中CytC蛋白表达明显恢复,胞浆中CytC蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而明显回落。此外,NaAsO。单独作用于HaCaT细胞24h,Procaspase-3蛋白表达降低,而Caspase-3活化程度均显著高于对照组（P〈0．01）,tBHQ预处理12h后再暴露于NaAsO2,Procaspase-3蛋白表达均明显高于相同浓度砷单独作用组,而且Caspase-3酶活力得到明显抑制,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。NaAsO：单独作用于HaCaT细胞24h,与对照组相比Bcl-2蛋白表达降低,而Bax蛋白表达明显升高。tBHQ预处理12h后再分别暴露于NaAsO2,Bcl-2蛋白表达明显恢复,而Bax蛋白表达则随tBHQ剂量的增加而减少。结论tBHQ能够影响线粒体凋亡途径拮抗NaAsO2诱导的人皮肤角质细胞凋亡;tBHQ能够诱导调控凋亡相关蛋白Bcl-2／Bax从而发挥抗凋亡作用。     

siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子,其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高,并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响,从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞,以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达,CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比,EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05）,侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF,P＜0．05）,细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力,证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。     

人乳腺癌上皮细胞miR-217对EZH2表达的调控作用

目的 验证乳腺癌上皮细胞中miR-217是否通过直接作用于homolog2 zeste基因增强子（EZH2）3＇UTR调控EZH2表达.方法 利用RT-PCR技术检测人正常乳腺上皮细胞系HBL-100及乳腺癌上皮细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞株中的miR-217,在低表达miR-217细胞株中转染miR-217模拟物（miR-217 minics）,在高表达miR-217细胞株中转染miR-217抑制剂（miR-217 inhibitor）;Western blot法检测各实验细胞中的EZH2蛋白.用含有miR-217野生型及突变型识别位点的EZH2 3＇UTR载体（UTREZH2-UTR-WT和EZH2-UTR-MUT）质粒分别转染人胚肾细胞293T,检测其相对荧光素酶活性.结果 miR-217在MDA-MB-231细胞中低表达,转染miR-217 minics后,其EZH2蛋白表达下降;miR-217在HBL-100中高表达,转染miR-217 inhibitor后,其EZH2蛋白表达增高.人胚肾细胞293T中EZH2-UTR-WT的相对荧光素酶活性低于EZH2-UTR-MUT,两者相比,P＜0.05.结论 在乳腺癌上皮细胞中,miR-217对EZH2的表达具有调控作用,且miR-217通过直接靶向EZH2 3＇UTR调控EZH2表达.     

RNA干扰沉默Cyclin D1基因对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨以细胞周期蛋白（Cyclin）D1为靶基因的RNA干扰对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响,为胰腺癌的靶向治疗提供依据。方法用含有10％FBS的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中常规培养AsPC-1细胞,至对数生长期后接种于96孔培养板中,随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组,并采用Lipo-fectamine^TM 2000脂质体分别转染Cyclin D1-小干扰RNA（siRNA）、阴性对照siRNA、脂质体,48h时收集细胞。应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞体外增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率（AI）。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞生长速度明显减慢,G0／G1细胞比例显著增大、S期细胞比例则明显降低、AI显著升高（P均〈0．01）。结论Cyclin D1-siRNA能通过沉默靶基因表达抑制AsPC-1细胞生长、改变细胞周期分布、诱导细胞凋亡,可作为胰腺癌基因治疗的一个有效靶点。     

Potential roles of EZH2, Bmi-1 and mi R-203 in cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma cell line Hep3B

AIM: To investigate the potential roles of enhancer of zeste homolog2(EZH2), Bmi-1 and mi R-203 in cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma(HCC) cell line Hep3 B.METHODS: A total of 73 patients who underwent surgical resection at Fuzong Clinical Medical College of Fujian Medical University were enrolled in this study. Hep3 B cells were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37?℃. Vectors that containing c DNA of the EZH2 gene or mi R-203 targeted sh RNA plasmid were constructed, and then transfected into Hep3 B cells. The m RNA expression of mi R-203, EZH2, and Bmi-1 was analyzed using quantitative real-time polymerase chain reaction analysis, and the protein levels of EZH2 and Bmi-1 were detected by Western blot analysis. Effect of EZH2 or mi R-203 on cell proliferation was observed by methyl thiazolyl tetrazolium assay, and cell apoptosis was assessed using flow cytometry. Besides, effect of EZH2 or mi R-203 on tumor cell invasion was detected using Transwell assay.RESULTS: The m RNA levels of EZH2 and Bmi-1 in HCC tissues and in Hep3 B cells were significantly higher compared with those in normal samples(P 0.01), while mi R-203 level was significantly lower in HCC tissues(P 0.01). Hep3 B cells transfected with EZH2-sh RNA or mi R-203-sh RNA showed lower expression levels of EZH2 and Bmi-1(P 0.05). Compared with controls, Hep3 B cells transfected with EZH2-sh RNA had relative slow cell proliferation, indicating that low expression of EZH2 and Bmi-1 and overexpression of mi R-203 could inhibit Hep3 B cell proliferation(P 0.05). The average apoptosis rate of Hep3 B cells transfected with EZH2-sh RNA vector was about 18.631%, while that of Hep3 B cells transfected with sh RNA vector was about 5.33%, suggesting that EZH2 was down-regulated by transfecting with EZH2-sh RNA, and the down-regulated EZH2 contributed to the cell apoptosis. Low expression of EZH2 and Bmi-1 and overexpression of mi R-203 could reduce Hep3 B cell invasion(P 0.05).CONCLUSION: Our study suggests that EZH2 and Bmi-1 are up-regulated while mi R-203 is downregulated in Hep3 B cells. Mi R-203 may contribute to the metastasis and enhance apoptosis of HCC cells by regulating EZH2 and Bmi-1. Our study may provide a theoretical basis for metastasis of HCC and targeted therapy of HCC.