EntransterTM纳米载体介导大鼠角膜CD25siRNA转染的效果及安全性评估

背景 基因转染是多种眼病基因治疗的有效方法,理想的非病毒载体是研究角膜基因治疗的关键因素,选择高转染率、基因高表达、低毒性的非病毒载体是成功实施基因治疗的前提. 目的 探讨EntransterTM、脂质体非病毒载体对正常SD大鼠角膜转染CD25 siRNA的转染率和安全性,筛选角膜基因转染的最佳载体.方法 应用随机数字表法将80只雄性SPF级成年SD大鼠随机分为EntransterTM-CD25 siRNA 组、脂质体-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,每组20只,均以右眼作为实验眼.实验眼眼表麻醉后刮除角膜上皮,按照分组不同分别用EntransterTM-CD25 siRNA、脂质体-CD25 siRNA、单纯CD25siRNA和生理盐水各50μl点眼.于点眼后12h、24 h、3d和7d在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼表组织反应,检查各组大鼠角膜表面绿色荧光个数.分别于上述时间点处死各组大鼠各4只并获取角膜组织,采用苏木精-伊红染色法行角膜组织病理学检查;采用罗丹明染色行荧光检测,评估各组大鼠角膜基因转染的转染率;采用TUNEL染色法检测实验眼角膜细胞的凋亡情况以评估各种转染载体的安全性;采用免疫荧光技术检测角膜组织中CD11b的表达. 结果 EntransterTM-CD25 siRNA组大鼠角膜表面的荧光染色数量及强度明显高于脂质体-CD25 siRNA组,单纯CD25 siRNA组大鼠角膜荧光染色出现早,但转染后24 h角膜荧光染色消失.角膜组织病理学检查显示,各组大鼠行基因转染后脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜上皮水肿和角膜炎性细胞浸润程度较EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组严重,角膜基质层和内皮层未发现异常,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜炎性细胞数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义(均P=0.00).TUNEL检测发现,基因转染后12h和3d,脂质体-CD25siRNA组大鼠角膜细胞凋亡数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义(均P=0.00).免疫荧光检测显示,CD11b荧光主要分布于角膜上皮层和角膜基质层,随着基因转染后时间的延长,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜组织中CD11b的表达量逐渐增加,基因转染后24 h时荧光强度达峰,随后逐渐减弱,至转染后第7天仍可见弱荧光.EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25siRNA组和生理盐水组大鼠角膜组织中均未发现CD11b的荧光表达. 结论 EntransterTM纳米材料作为载体转染CD25 siRNA于正常SD大鼠角膜具有转染效率高、毒性低、不引起角膜免疫反应的特点,可作为角膜疾病基因治疗的合适载体.     

曲霉菌预处理前后大鼠角膜上皮TLR4受体的表达

目的：检测曲霉菌预处理前后大鼠角膜上皮TLR4受体的表达变化。 方法：健康Wistar大鼠24只随机分为A、B、C、D共4组,A组不予特殊处理,B、C、D三组以罩杯法刺激大鼠角膜4h建立曲霉菌刺激模型。B组在完成刺激后立即取角膜上皮,C组在96h后取角膜上皮,D组在96h后重复刺激,其后取角膜上皮,采用Real-time PCR法检测所取上皮组织中TLR4受体mRNA的表达。 结果：罩杯法建立大鼠角膜曲霉菌刺激模型后TLR4受体mRNA的表达明显上升,但96h后已趋于正常,再次刺激后受体mRNA的表达变化与初次刺激差异无统计学意义（P>0.05）。 结论：罩杯刺激法可以使TLR4受体mRNA表达上升,但受体并未因曲霉菌刺激而产生基础表达量的变化,重复刺激后受体表达亦无明显差异。     

烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜IL-6和IL-10的表达

目的 探讨大鼠角膜真菌感染后角膜局部细胞因子的表达.方法 在24只大鼠左眼角膜上制作烟曲霉菌性角膜炎(AFK)模型为实验组,右眼为对照组.在感染后早、中、晚期取下角膜组织,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)在不同病程角膜组织中的表达.结果 在实验组角膜中,IL-6早期即大量表达,中期炎症反应高峰时达高峰,以后逐渐下降;IL-10在早期表达最高以后逐渐下降.结论 IL-6在AFK病程中是一个敏感的炎性因子,与局部的炎症反应程度一致.IL-10在AFK病程中呈逐渐下降趋势.     

核转录因子κB在脂多糖诱发的大鼠角膜炎中的表达及二硫代氨基甲酸吡咯烷对其的影响

目的 探讨核转录因子κB（NF—κB）及其诱导的细胞因子在大鼠角膜炎中的表达及二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对其表达的影响。方法 选择112只大鼠建立角膜炎模型,按随机数字表法分为炎性组56只和PDTC预处理组56只。模型制作前30min,大鼠球结膜下分别注射生理盐水（炎性组）和PDTC（PDTC预处理组）,每组按脂多糖（LPS）刺激后不同时间又分为0．5、1．0、3．0、6．0、12．0、24．0及72．0h亚组,每亚组8只鼠。裂隙灯显微镜下观察大鼠的眼部变化;病理组织切片观察角膜形态学改变;免疫组织化学染色检测角膜NF—κB p65的表达;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测角膜肿瘤坏死因子α（TNF—α）mRNA的表达。结果 LPS刺激后炎性组大鼠角膜组织明显水肿,大量炎性细胞浸润,胶原纤维排列紊乱;免疫组织化学染色显示LPS刺激后0．5h即可见NF—κB阳性细胞,并表达逐渐增强,3．0～12．0h最强,0．5～24．0h间均较PDTC预处理组明显增多（P〈0．01）;TNF—αmRNA的表达在LPS刺激后0．5h就开始升高,3．0～12．0h最强,0．5～24．0h间均较PDTC预处理组明显增高（P〈0．01）。结论 NF—κB及其诱导的TNF—α在角膜炎中发挥重要作用,PDTC可能通过抑制NF—κB的活性减轻角膜损伤。（中华眼科杂志,2006,42：699—703）     

替普瑞酮对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

背景视网膜缺血-再灌注损伤是眼科常见的病理过程,可引起永久性的视力障碍,严重影响患者的视功能,是目前国内外研究的重点课题之一。目的探讨替普瑞酮对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用。方法44只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组4只、单纯模型组20只和替普瑞酮治疗组20只。单纯模型组及替普瑞酮治疗组造模前分别给予大鼠生理盐水和替普瑞酮灌胃,1周后采用前房加压法制作大鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型,并分别于再灌注后6、24、48、72h制备视网膜铺片,经苏木精-伊红染色观察各组大鼠视网膜组织结构的变化,采用免疫组织化学法检测大鼠视网膜中热休克蛋白70（HSP70）和caspase-3的表达。结果视网膜缺血-再灌注后1～6h单纯模型组大鼠角膜及视网膜出现水肿,24h视网膜水肿加重,72h视网膜水肿减轻、结构较紊乱。替普瑞酮治疗组大鼠各时间点视网膜水肿较单纯模型组轻,缺血-再灌注后72h大鼠视网膜结构损害较单纯模型组减轻。正常对照组大鼠视网膜未见HSP70及caspase-3呈阳性表达。单纯模型组大鼠在再灌注后6h可见视网膜神经节细胞（RGCs）中HSP70呈阳性表达,再灌注后24h达高峰,之后逐渐下降。替普瑞酮治疗组各时间点HSP70在大鼠RGCs中的表达较单纯模型组明显增强,差异均有统计学意义（P〈0．05）。再灌注后6h可见单纯模型组大鼠RGCs中caspase-3表达,24h时caspase-3的表达量达高峰,48h后开始下降,72h仅有少量表达,而各时间点替普瑞酮治疗组视网膜中caspase-3的表达较单纯模型组大鼠明显减弱,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论在视网膜缺血-再灌注损伤大鼠模型中,替普瑞酮可通过上调视网膜中HSP70的表达和下调caspase-3的表达对RGCs起保护作用。     

Avastin对大鼠角膜结构和缺损愈合速率的影响

目的 评估贝伐单抗(bevacizumab,商品名Avastin)对大鼠角膜上皮缺损愈合速率及对正常大鼠角膜形态结构的影响.方法 健康雌性SD大鼠随机分为缺损组和正常组,缺损组包括实验A组和对照A组,均建立角膜上皮缺损模型,每组4只(8眼);正常组包括实验B组和对照B组,每组2只(4眼).上述实验组双眼均滴5 g·L-1的Avastin,对照组均滴生理盐水.A组于造模后12 h、18 h、24 h、36 h荧光素染色裂隙灯观察角膜上皮缺损修复情况,直至上皮缺损愈合;B组在连续滴眼7 d后做角膜组织病理学观察和透射电镜检查.结果 裂隙灯观察显示,在24 h内实验A组和对照A组角膜上皮愈合速率一致,36h时角膜上皮均已愈合;实验A组和对照A组在12 h、18 h、24 h角膜上皮缺损平均愈合速率比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05);正常组滴眼7 d后,与对照B组比较,实验B组的光镜和电镜检查未见角膜结构改变及炎性细胞浸润.结论 短期局部应用5 g·L-1Avastin对大鼠角膜上皮缺损愈合速率和正常角膜结构无影响.     

整合素a_5亚单位在大鼠角膜碱烧伤愈合中的表达

目的　观察碱烧伤后角膜创面上皮愈合过程中整合素 α5亚单位的表达 ,探讨整合素 α5在角膜上皮损伤愈合中的作用。方法　 Wistar大鼠 1 8只 ,随机分为 6组 ,每组 3只 ,其中 1眼为碱烧伤模型 ,另 1眼为自身对照眼。对制造模型眼后 0、7h、1、3、7、1 4d的角膜标本 ,HE染色行组织病理学检查、间接免疫荧光和免疫组织化学染色观察整合素 α5亚单位的表达与分布。结果　伤后 7h,邻近上皮细胞开始表达 α5亚单位 ,伤后 1、3、7d,角膜上皮层显示 α5表达逐渐增加 ,差别有显著性 (P<0 .0 5)。伤后 1 4d,实验组表达仍呈上升趋势。结论　整合素 α5亚单位积极参与了碱烧伤后角膜上皮损伤愈合的过程     

二十碳五烯酸对大鼠角膜新生血管核转录因子KB及细胞因子表达的抑制作用

背景角膜新生血管（CNV）是炎症性角膜病变导致视力下降和角膜移植后发生排斥反应的重要原因,其发生机制和治疗一直是国内外角膜病研究的热点。目的探讨二十碳五烯酸（EPA）对碱烧伤大鼠CNV核转录因子KB（NF—KB）、白细胞介素1α（IL一1αt）、IL一6表达的影响及作用机制。方法用浸有1mol／LNaOH的3mm圆形滤纸贴附于72只SD大鼠的右眼角膜中央30s制作角膜碱烧伤模型,用随机数字表法将大鼠随机分为3个组,另6只匹配的正常大鼠作为正常对照组。碱烧伤0．02mgEPA治疗组和碱烧伤0．03mgEPA治疗组大鼠分别于碱烧伤后即刻结膜下注射0．04ml剂量为0．02mg或0．03mgEPA,碱烧伤模型组结膜下注射0．04ml生理盐水,正常对照组大鼠未行结膜下注射。大鼠干预后每天裂隙灯下观察CNV的生长面积和角膜水肿。分别于造模后24h,4、7、14d过量麻醉处死动物后制备角膜标本,采用苏木精一伊红染色法检测各组大鼠角膜的组织病理学变化,免疫组织化学方法检测各组大鼠角膜组织中CD34的表达以计数血管内皮细胞,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及蛋白印迹法分别检测各组大鼠角膜组织中IL-1α-mRNA和IL．6mRNA的表达及NF—KBp65的蛋白表达。结果裂隙灯下见造模后2～4d,CNV缓慢生长,角膜水肿,上皮缺损;造模后7～10d,CNV面积增加,角膜水肿减轻;造模后14d,CNV面积最大,血管变细。苏木精一伊红染色显示,碱烧伤后7d碱烧伤组角膜上皮部分缺损,基质层水肿明显,可见较多炎性细胞及大量CNV;碱烧伤0．03mgEPA治疗组与碱烧伤0．02mgEPA治疗组均可见角膜上皮修复,基质层水肿减轻,少量炎性细胞,未见CNV。碱烧伤后7d和14d,碱烧伤0．02mgEPA治疗组CNV相对面积分别为（15．80±6．43）％、（11．06±2．14）％,碱烧伤0．03mgEPA治疗组为（16．10±7．41）％、（11．06±2．51）％,均明显小于碱烧伤组的（84．74±7．77）％、（89．63±7．50）％,差异均有统计学意义（P〈0．05）。碱烧伤后7d,碱烧伤组CD34在CNV的内皮细胞中呈强阳性表达,而在碱烧伤0．02mgEPA治疗组、0．03mgEPA治疗组角膜中未见表达。RT—PCR检测结果表明,碱烧伤后4d,碱烧伤0．02mgEPA治疗组、0．03mgEPA治疗组IL一1α、IL一6mRNA在角膜组织中的表达量明显低于碱烧伤组,蛋白印迹检测证实NF—KBp65蛋白在角膜组织中的表达低于碱烧伤组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论EPA能够抑制NF—KB、IL一1α、IL一6的表达,从而抑制碱烧伤后CNV的生长。     

重组人BIGH3蛋白滴眼液对兔角膜上皮损伤的修复作用

背景角膜上皮损伤可导致角膜溃疡和基质混浊，甚至出现不可逆的视功能损害，以往采用的药物治疗仅能缓解刺激症状，而促进角膜上皮细胞再生的作用较弱，因此寻求能有效调控角膜上皮细胞生长，从而有效治疗角膜上皮损伤的药物至关重要。目的探讨重组人BIGH3蛋白滴眼液对角膜上皮损伤的修复作用。方法50只清洁级健康成年新西兰大白兔，均取右眼为实验眼，其中2只兔制作角膜上皮损伤模型后即刻行裂隙灯显微镜检查及角膜荧光素染色，眼前节照相后处死；48只兔按照随机数字表法随机分为重组人表皮生长因子（EGF）衍生物组（阳性对照组）、生理盐水组（阴性对照组）、质量分数0．25％重组人BIGH3蛋白滴眼液组及O．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组，每组12只。在直径7mm环钻内滴人体积分数20％乙醇，置于角膜中央区60s，然后用角膜刮匙刮去角膜上皮，制作角膜上皮缺损模型。术后各组兔眼分别点用相应药物，每天4次，分别于术后12、24、36、48、72h行裂隙灯显微镜检查及角膜荧光素染色，于12、24、36、48h采用抽签法各处死2只实验兔，72h时各处死4只实验兔，制备角膜组织标本并行苏木精一伊红染色，观察并比较各组兔眼在不同时间点角膜上皮修复情况，应用计算机图像处理系统测量各组兔眼不同时间点角膜上皮愈合面积。结果各组兔眼用药后均未发现任何眼部刺激症状。组织病理学研究发现，造模后即刻全层角膜上皮缺损，随着时间的延长，实验组及对照组兔角膜上皮缺损区皆逐渐变小，可见周边角膜上皮向中央缺损区移行，细胞层数逐渐增加，细胞排列极向逐渐趋于规则。重组人EGF衍生物组、生理盐水组、0．25％及0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组角膜上皮愈合速率分别为15．00、13．81、18．05、18．86mm。／d。与生理盐水组比较，术后12、24、36、48h，0．25％、0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组及重组人EGF衍生物组角膜损伤面积明显缩小，差异均有统计学意义（均P=0．000），但造模12、24、36h，重组人EGF衍生物组与生理盐水组比较差异均无统计学意义（P=0．321、0．057、0．126）。与重组人EGF衍生物组比较，术后各时间点0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组角膜损伤面积明显缩小，差异均有统计学意义（P=0．042、0．039、0．025、0．008），0．25％重组人BIGH3蛋白滴眼液组角膜损伤面积仅在术后12h、24h明显缩小，差异均有统计学意义（P=0．047、0．042）。术后各时间点0．25％、0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组间角膜损伤面积的差异均无统计学意义（P：0．358、0．259、0．108、0．062）。术后72h，生理盐水组角膜损伤面积为（0．51-＋0．42）mm2，而其他3个组角膜上皮均完全修复。角膜上皮修复曲线表明，0．25％及0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液组角膜上皮修复的相对面积均优于重组人EGF衍生物组和生理盐水组。结论0．25％及0．5％重组人BIGH3蛋白滴眼液对角膜上皮损伤的愈合有明显的促进作用，其作用优于EGF。     

高糖抑制角膜缘干细胞间质性及其迁移能力的研究

目的　探讨高糖环境对角膜缘干细胞增殖、迁移能力及表面分子标志的影响。方法　通过细胞免疫荧光、细胞增殖检测（CCK-8）、划痕和Transwell实验观察角膜缘干细胞在高糖环境下的迁移及增殖能力的改变。选取16只SPF级大鼠用链脲霉素进行糖尿病造模，14只正常SPF级大鼠作为对照组，刮除两组大鼠角膜上皮观察上皮创伤愈合情况，采用HE染色和免疫组织化学染色探讨糖尿病对角膜缘干细胞表面分子标志及细胞状态的影响。结果　高糖可导致体外培养的角膜缘干细胞增殖减慢，24 h、48 h及72 h增殖率为0.728、0.345及0.395，较对照组明显降低（P<0.05），迁移功能障碍（48 h时正常对照组迁移率为100%，高糖组为17.6%）；高糖组细胞表面分子β-catenin和vimentin的mRNA和蛋白表达水平降低、细胞内定位异常。糖尿病大鼠角膜上皮创伤后愈合延迟，角膜组织HE染色发现糖尿病大鼠角膜上皮层变薄，基底细胞结构紊乱、形态异常。角膜免疫组织化学染色发现与对照组相比，角膜基底细胞的vimentin和β-catenin蛋白表达明显降低。结论　高糖可导致角膜缘干细胞迁移障碍和增殖抑制，其损伤机制与高糖导致角膜缘干细胞表面分子标志的丢失有关。     

明胶酶在兔真菌性角膜炎病理改变中的作用研究

目的探讨明胶酶包括基质金属蛋白酶（MMP）2与MMP-9在兔真菌性角膜炎病理改变中的作用。方法80只新西兰白兔随机分为4组,每组20只。其中3组为实验组,兔右眼分别注入100μl茄病镰刀菌、烟曲霉菌及白色念珠菌的悬液;另1组为对照组,兔右眼注入等量生理盐水。免疫组织化学方法观察MMP-2与MMP-9的来源,明胶酶谱法检测其活性。组织病理学方法观察炎性细胞的浸润、角膜细胞外基质（ECMs）的降解以及真菌菌丝在角膜内的生长方式与入侵深度。结果MMP-2主要由角膜基质细胞产生,真菌感染后5d检测出活性,8d活性升高。MMP-9主要来源于嗜中性粒细胞,接种后1d即检测到活性,3d活性升高,之后逐渐下降。茄病镰刀菌感染后3d,角膜内散在嗜中性粒细胞,浅层ECMs被降解,菌丝平行于角膜基质纤维生长。烟曲霉菌和白色念珠菌感染后3d,角膜内可见大量嗜中性粒细胞,周围ECMs降解明显,菌丝表现为垂直生长。接种后8d,茄病镰刀菌和白色念珠菌感染的角膜内炎性细胞和菌丝明显减少,而烟曲霉菌感染的角膜变化不明显。结论茄病镰刀菌、烟曲霉菌及白色念珠菌感染兔角膜后,产生的明胶酶活性明显不同;明胶酶对降解角膜ECMs发挥了重要作用;随着ECMs降解程度的不同,菌丝在角膜内的生长方式、入侵深度等病理改变出现差异。     

主要致病真菌在角膜内生长方式的研究

目的 研究白色念珠菌、茄病镰刀菌、烟曲霉菌在角膜内的生长方式.方法 应用表层角膜植片术,在植床与植片间注射真菌菌液,建立浅层真菌性角膜感染的兔模型.28只健康成年家兔,分为白色念珠菌感染组、茄病镰刀菌感染组、烟曲霉菌感染组,每组随机取8只兔,并设立4只兔为对照组.进行组织病理学及透射电镜观察.结果 大体观察发现3种真菌感染的临床表现各有特点.组织病理学及透射电镜检测可见白色念珠菌垂直生长,茄病镰刀菌平行于角膜板层生长,烟曲霉菌斜行生长.结论 3种不同真菌在角膜内生长方式不同,可能存在不同的致病机制.     

Roles of adherence and matrix metalloproteinases in growth patterns of fungal pathogens in cornea

PURPOSE: To investigate the roles of adherence and matrix metalloproteinases (MMPs) in growth patterns of major fungal pathogens in cornea. METHODS: Ninety-six eyes in 96 rabbits were equally divided into four groups receiving inoculation of fungal conidia of Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Fusarium solani, and Penicillium citreo-viride, respectively, to induce fungal keratitis. Corneas in each group were obtained at 2, 8, 16 hr, and 1, 2, 3, 5, and 8 days after inoculation and were subjected to scanning electron microscopy, histopathological examination, and gelatin zymography. Eight saline-inoculated eyes in another eight rabbits served as controls. RESULTS: All eyes in the fungus-inoculated groups developed fungal keratitis. The binding of conidia to corneal epithelial basement membrane was initiated earlier in the A. fumigatus and C. albicans groups than in the F. solani and P. citreo-viride groups. Destruction of basement membrane began at 1 to 3 days. Histopathologically, infiltration of inflammatory cells was more evident in the A. fumigatus and C. albicans groups than the F. solani and P. citreo-viride groups at 3 days. The hyphae of A. fumigatus and C. albicans traversed the cornea in a plane perpendicular to the stromal lamellae, whereas the hyphae of F. solani and P. citreo-viride lay parallel to the corneal lamellae. MMP-9 and MMP-2 were found in all infected corneas. At 3 days, proteolysis was most active; the level of MMP-9 was higher in the A. fumigatus and C. albicans groups than in the F. solani and P. citreo-viride groups. There were positive correlations among the number of binding conidia, degree of inflammation, and level of MMP-9 (p < 0.05). CONCLUSIONS: The adherence ability, chemotaxis to neutrophils, and MMP-9 expression level differ in eyes with different fungal pathogens, which may contribute to the different growth patterns of fungi in cornea.     

A partial-thickness epithelial defect increases the adherence of Pseudomonas aeruginosa to the cornea

Some patients with infectious keratitis have no clinically demonstrable corneal abrasion predisposing them to infection. Subtle, undetectable corneal injuries may facilitate bacterial adherence to the cornea, eventually leading to keratitis. To study this concept, we have developed a rabbit model in which a partial-thickness corneal epithelial defect was induced by filter paper impression on the cornea that removed one to two layers of corneal epithelium. Following this injury, the corneas were incubated with Pseudomonas aeruginosa, washed, and the number of bacteria adhering to the injured corneas as well as to control corneas was quantitated. Corneas treated with filter paper, either ex vivo or in vivo, allowed 20 times more bacteria to adhere than did the untreated control corneas (P less than 0.01). This superficial epithelial defect increased Pseudomonas adherence to the cornea for up to 72 hr after injury. When corneal injury was extended to the stroma, the adherence of Pseudomonas was further augmented as compared to adherence to the superficially injured cornea. Thus, we conclude that a clinically subtle, partial-thickness corneal epithelial injury can markedly facilitate the adherence of Pseudomonas aeruginosa, which may be an important predisposing factor for infectious keratitis.