肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）-4成纤维生长因子4-（FGF-4）诱导人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 （1）取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心＋贴壁培养获取骨髓间充质干细胞（MSCs），将MSCs通过CD45、GlyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCS。（2）将hMAPCs用HGF＋FGF-4进行诱导分化。实验分组：A组：HGF（20ng／m1）＋（FGF-4）10ng／m1诱导hMAPCS；B组（阳性对照组）：L-02人肝细胞株；C组（阴性对照组）：未加任何诱导因素的hMAPCs。（3）免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白（A1b）、甲胎蛋白（AFP），细胞角蛋白-18（CK-18）等肝细胞特征的表型变化评计数阳性细胞比率。（4）逆转录-聚合酶链反应检测不同诱导分化阶段细胞的A1b、AFP，CK-18的mRNA转录。（5）Western blot检测诱导分化第21，35天后细胞的A1b表达。结果（1）免疫细胞化学结果：A1b、CK18在诱导组中不同时间段基本为阳性着色；AFP在诱导分化第7天为阳性着色，在诱导第14，21天为阴性着色。（2）逆转录聚合酶链反应结果：作为不成熟肝细胞表型的AFP，在诱导分化的第7天有mRNA阳性表达；作为成熟肝细胞表型的A1b及CK-18，在不同时间段mRNA均为阳性表达。（3）Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的A1b表达。结论hMAPCS在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外诱导分化为肝细胞的可行性和方法,观察分化后的细胞白细胞表面抗原表达的改变。方法采用酶学法从脐带全层组织中分离UC-MSCs,采用改良的肝分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化。诱导后2、4周,观察细胞形态,免疫荧光细胞化学染色法检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）;RT-PCR检测肝细胞标志性基因AFP、ALB和CK19 mRNA。ELISA法检测诱导后的细胞培养液中ALB水平。流式细胞仪检测诱导后细胞白细胞表面抗原HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ。结果从人脐带基质中分离培养的UC-MSCs在向肝细胞诱导分化培养体系的培养下,细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、ALB mRNA和蛋白,诱导后的UC-MSCs以时间依赖方式产生ALB,诱导后的细胞不表达HLA-DR。结论UC-MSCs具有向肝细胞分化的潜能,分化后的M细胞仍具有低免疫原性。     

小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的实验研究

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性，为肝细胞移植提供实验基础。方法HGF100ng／ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化，于诱导的第0、7、l4、21、28天，观察细胞形态特征；半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)mRNA水平的表达；免疫细胞化学法检测ALB、AFP和细胞角蛋白l9(CK19)蛋白水平的表达。结果新鲜分离的骨髓干细胞ALB及AFP mRNA呈弱阳性。在非诱导组，培养7d时ALB mRNA已检测不到，AFP mRNA明显减弱，14d时消失。在诱导组，7d时ALB mRNA检测不到，14d时再次出现阳性条带，21d时表达量最大，而AFP mRNA在诱导组始终呈阳性，14d时表达量最大，以后逐渐减少。免疫细胞化学结果与RT-PCR结果基本一致，但CK19蛋白始终阴性。结论小鼠骨髓干细胞在HGF单独作用下能诱导分化为肝细胞样细胞，诱导分化的最佳时期是2～3周。     

aFGF、HGF体外诱导小鼠ESC向肝细胞定向分化及标志物研究

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,a FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外定向诱导分化作用及诱导后肝细胞标志物的表达水平。方法体外培养小鼠ESC使其发育成拟胚体,然后加入a FGF、HGF诱导ESC定向分化成肝细胞。收集培养上清液,RIA法测定甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、白蛋白(albumin,ALB)浓度。PCR和免疫印迹法检测ALB、细胞角蛋白8(CK8)以及细胞角蛋白18(CK18)在细胞内mRNA和蛋白表达水平。结果 ESC培养5 d后发育成为拟胚体,加入不同浓度a FGF继续培养,5 d后AFP浓度降低,ALB浓度升高,与对照组相比有显著性差异。细胞内ALB、CK8及CK18表达水平明显升高。一次诱导后加入HGF,继续诱导5 d,上清液中AFP浓度降低,ALB浓度升高,具有浓度依赖性。ALB、CK8及CK18在细胞内表达升高。结论体外培养小鼠ESC,加入a FGF、HGF后可诱导其向肝细胞定向分化。肝细胞标志物AFP水平明显降低,ALB、CK8以及CK18表达水平明显升高。     

脐血间充质干细胞的体外扩增及向类肝细胞分化的实验研究

目的探讨人脐带血间充质干细胞（UBC-MSCs）向类肝细胞定向分化的可能性。方法无菌条件下采集新生儿脐带血75份,采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合分离UBC－MSCs,体外培养传代,获得第4代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定,并应用a－FGF、b－FGF、HGF、OSM等多种成分,分阶段向肝细胞定向诱导分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,取诱导后4周和6周的细胞分别采用RT-PCR法检测ALB、AFP和CK－19基因mRNA水平,分析类肝细胞诱导表达情况。结果按10。／ml接种,用含15％FBS的DMEM／F12培养基培养可成功获取UBC—MSCs。细胞呈长梭形,细胞表面抗原测定显示强烈表达CD29、CD44,而不表达造血细胞的标志物CD34、CD45。分阶段诱导6周后,细胞形态呈多角形,并检测到肝细胞表面标志物白蛋白、AFP和CK-19。结论新生儿脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增,分阶段诱导可分化为类肝细胞。     

共同培养诱导骨髓基质干细胞向肝细胞分化的研究

目的 探索大鼠骨髓皋质干细胞（MsCS）向肝细胞分化的能力，及肝细胞生长的微环境埘其诱导分化的作用。方法 采用梯度离心法，获取大鼠骨髓基质干细胞；改良的两步法获取大鼠肝细胞。将鉴定的MsCS和肝细胞以半透膜相隔共同培养，以单独培养的MSCs作对照。在第1、3、7．14．21、28天，分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学分析检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、细胞角蛋白l8（CK-l8）的基因和蛋白表达。结果在MSCs与肝细胞共同培养过程中，MSCs出现明显的细胞形态、体积和数量变化，可见双核或多核细胞，细胞轮廓较清晰。RT-PCR检测：共同培养的MSCs第7天即出现AFP基因表达，第14天表达增强，第21天表达减弱；第14天开始出现白蛋白、CK-18基因表达，并持续表达。单独培养的MSCs均无表达。共同培养的MSCs，于第7天进行免疫细胞化学检测，AFP即呈阳性；第14天白蛋白和CK-18也呈阳性；单独培养的MSCs未见AFP、白蛋白及CK-18表达。结论 大鼠骨髓基质干细胞与肝细胞共同培养，可被诱导分化为肝细胞。     

不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导类肝细胞的影响

目的:探讨实验性大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、诱导的最优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据.方法:采用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠MSCs.经培养传代获得纯化的MSCs.采用析因实验,设不同诱导时间、不同浓度的FBS、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对纯化的MSCs进行分组诱导培养.留取15、2l、27 d细胞培养液进行白蛋白(A1b)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAs)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18和CK-19.结果:诱导15、21、27 d,各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),21 d诱导组AFP水平最高:15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义,21、27d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),27 d诱导组白蛋白水平最高.27d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18、CK-19均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.多因素方差分析表明,Mscs体外最佳诱导条件为含200mL/LFBS的DMEM 肝细胞生长因子(HGF)20Ug/L 成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)20UG/L.结论:HGF和FGF-4可在体外诱导实验性大鼠Mscs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:不同浓度的FBS、HGF和FGF-4影响MSCs的体外分化;MSCs可作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源.     

体外不同诱导条件下对大鼠胚胎肝干细胞分化影响的实验研究

目的探讨和比较不同体外条件对大鼠胚胎肝干细胞分化成熟的影响。方法将取自孕14d胎龄F344大鼠胚胎肝组织的肝干细胞分别接种至含10、20、40ng/mLHGF,0.5%、1%、2%二甲基亚砜(DMSO),10ng/mLHGF+0.5%DMSO、20ng/mLHGF+1%DMSO、40ng/mLHGF+2%DMSO以及空白的培养基中进行体外培养15d;诱导15d后,ELISA检测和比较不同组细胞内甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的浓度,实时定量PCR比较不同组细胞ALB、葡萄糖6-磷酸酶(G-6p)、角蛋白8、18(CK-8、CK-18)的mRNA的表达水平。结果与空白对照组相比,诱导15d后各实验组肝干细胞ELISA检测AFP明显下降(P0.01),ALB明显升高(P0.01);实时定量PCR结果表明各实验组ALB、G-6P、CK-8、CK-18mRNA水平较对照组均明显升高,其中大鼠胎肝干细胞体外最佳诱导条件为20ng/mLHGF+1%DMSO(P0.05)。结论 HGF和DMSO均可在体外诱导大鼠肝干细胞分化,不同浓度HGF和DMSO影响其分化成熟程度;HGF、DMSO对大鼠胚胎肝干细胞的分化具有协同效应。     

脐带组织来源基质干细胞的肝细胞相关标志物分析

目的研究脐带组织来源基质干细胞（umbilical cord-matrix stem cells,UCMSCs）具备的部分肝细胞生物学特性。方法观察分离脐带基质干细胞细胞形态和免疫表型,利用免疫组化检测脐带基质干细胞的CK-18、AFP、ALB和肝细胞抗原（hepatocyte paraf-fin 1,HepPar1）的表达,通过RT-PCR方法评价脐带基质干细胞的多种肝细胞特异性基因表达的稳定性。结果从脐带组织内分离出类成纤维细胞样的脐带基质干细胞,CD105表达阳性,CD45表达阴性;第4代脐带基质干细胞表达CK-18、AFP、ALB等蛋白,而不表达HepPar1;RT-PCR结果表明10代内脐带基质干细胞持续稳定表达ALB、CK-19、CPS-1、CYP1A1,而不表达CYP3A4。结论脐带基质干细胞是一种本身表达一定肝细胞标志物的间充质干细胞,可能更有利于向肝细胞分化或在移植后发挥更好的治疗作用。     

人骨髓来源多能成体祖细胞ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞的分化

目的:探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性．方法:(1)间接共培养:将第4代ZHJ-MAPCs和人肝细胞系L02仅培养液相通行间接共培养．分别于培养第1、3、5、7天应用免疫细胞化学法鉴定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝细胞特征性表型表达情况,并设阳性对照和阴性对照,计数阳性细胞比率;(2)直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的第4代ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×107／L)按照各50％比例混合行直接共培养．5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ—MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况．同样设阳性对照和阴性对照．结果:(1)间接共培养:AFP在ZHJ-MAPCs间接共培养第1天即表现为强阳性,随后表达逐渐减弱．ALB在共培养第1天有可疑阳性,第3天出现较强的阳性,第5天达到高峰．CK-18在培养第1、3天检测均为阴性,至第5天开始出现阳性,第7天表达较前增强．CK-19在各时间点均为阴性着色．(2)直接共培养:胞质内呈黄色荧光ALB和CK18的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs在共培养5 d时出现较多,而AFP阳性表达则仅出现在极个别细胞,该结果与阳性对照细胞荧光表达类似．结论:人骨髓来源的ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行间接或直接共培养均能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化,且直接共培养有提前趋势．     

结缔组织生长因子诱导大鼠前体细胞(WB-F344)向肝脏实质细胞分化

目的观察结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）对大鼠肝脏前体细胞（WB—F344）分化的影响,进一步观察细胞外基质的变化。方法采用MTF法检测CTGF对WB—F344细胞活性的影响。采用Wester Rblotting方法分别检测CTGF诱导WB—F344细胞后胆管细胞标志物CK-19及肝细胞标记物AFP、ALB的变化。采用Western blotting和实时荧光定量PCR检测细胞外基质相关指标金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase．TIMP）-1在mRNA水平和蛋白水平的变化。结果作用于WB—F344细胞24h后,CTGF组的细胞活性大于转化生长因子-β组（P〈0．05）。5ng／ml CTGF作用于WB—F344细胞24h后,可以明显改变WB—F344细胞表面标记物在蛋白水平的表达。幼稚肝细胞标记物AFP的表达是对照组的0．38倍（P=10．002）,成熟肝细胞标记物ALB和胆管细胞标记物CK-19的表达均增加,分别为对照组的3．5倍和1．58倍（P分别为0．000、0．002）。同时,5ng／ml CTGF可以上调WB—F344细胞TIMP-1在mRNA水平和蛋白水平的表达,分别为对照组的2．47倍和3．36倍（P=0．000、0．002）。结论5ng／ml CTGF有诱导肝脏前体细胞向肝脏实质细胞分化的趋势,并伴有WB—F344细胞外基质相关指标TIMP-1表达的上调。     

体外增殖培养的骨髓间充质干细胞移植后在脑梗死大鼠脑内的存活

目的观察应用维生素C（Vc）和碱性成纤维因子（bFGF）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖培养,移植到脑梗死大鼠体内后,在脑内的存活情况。方法①采用密度梯度离心及贴壁法分离大鼠BMSCs。按培养液中加入的不同因子分为4组：对照组、Vc组（50μg/m1）、bFGF组（1μg/L）以及Vc＋bFGF组（50μg/ml Vc和1μg/L bFGF）,在体外对BMSCs进行培养并观察各组细胞的增殖情况。采用MT丁比色法分别于培养第1、2、3、5和7天,测定细胞在450nm波长处的吸光度（A）值;采用流式细胞仪检测培养96h后的细胞周期。②采用线栓法制备20只大鼠右侧大脑中动脉闭塞2h模型,并随机分为2组：联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组（10只）和对照BMSCs移植组（10只）。将相应组别的BMSCs细胞移植人脑梗死24h后的大鼠体内。分别于移植后第1、2和3周,制备大鼠脑组织切片并行BrdU免疫组化染色。结果①形态学观察显示,Vc＋bFGF组的BMSCs增殖最快,对照组则相对缓慢。②各组细胞的A值于培养第2天开始增加,Vc组和bFGF组在第3天达到高峰（F=728．52和F=197．18,P〈0．05）,Vc＋bFGF组在第5天达到高峰（F=1771．32,P〈0．05）,第7天均有所下降。第2天起,bFGF组、Vc组与bFGF＋Vc组的A值均高于对照组;第3天起,Vc＋bFGF组高于Vc组与bFGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。③Vc组、bFGF组与Vc＋bFGF组细胞处于增殖期（s＋G2＋M期）的百分比均较对照组高,差异有统计学意义（P〈0．05）。④BMSCs移植后第2周,联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组大鼠脑组织切片中BrdU阳性细胞计数较对照组高;第3周两组阳性细胞计数均有下降,但前者仍较后者高。差异均有统计学意义（P〈0．01）;Brdu阳性细胞主要分布在梗死灶周围。结论Vc与bFGF均可促进大鼠BMSCs的增殖,二者联用较单用其一的效果更好;脑梗死大鼠移植增殖培养后的BMSCs,其在脑组织中的成活能力明显增强。     

脐血干细胞与骨髓干细胞联合移植治疗大鼠急性肝衰竭实验研究

目的：观察脐血干细胞和自体骨髓干细胞共同移植治疗D-半乳糖苷所致急性肝衰竭大鼠的疗效。方法采集大鼠脐血和骨髓中单个核细胞,以促肝细胞生长因子和干细胞因子培养3w,采用免疫细胞化学法检测白蛋白和甲胎蛋白表达情况;以D-半乳糖苷腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型,24 h后每日经鼠尾静脉分别注入脐血干细胞,或骨髓干细胞,或混合的脐血干细胞和骨髓干细胞,对照组注射等量生理盐水,治疗7d,观察4组大鼠存活率、肝功能和肝组织病理学变化。结果在促肝细胞生长因子及干细胞因子的诱导下,脐血干细胞和骨髓干细胞可以在体外扩增并分化为肝细胞;脐血干细胞移植、骨髓干细胞移植和联合细胞移植组大鼠9d 存活率分别为55.6%、50.0%和77.8%,均明显高于生理盐水对照组（16.7%,P〈0.01）;联合移植组存活率高于任何一种单纯干细胞移植（P〈0.01）。结论脐血干细胞和骨髓干细胞移植对大鼠急性肝损伤有一定的保护作用,两者联合移植有协同作用。     

In vitro differentiation of mouse bone marrow mononuclear cells into hepatocyte-like cells.

AIM:: It is imperative to explore some ways to gain the functional hepatocytes for hepatocyte transplantation. Bone marrow stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo and in vitro. We select fibroblast growth factor-4 (FGF-4), oncostatin M (OSM), hepatocyte growth factor (HGF) and epithermal growth factor (EGF) as differentiation factors, and design the appropriate directed differentiation medium in order to gain hepatocytes through directed differentiation of bone marrow stem cells. METHODS:: Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) were cultured in the directed differentiation media including FGF-4, OSM, HGF and EGF. In the course of cell differentiation, cell morphology was observed, and the expression patterns of some genes of the hepatocyte were validated and confirmed by RT-PCR. The ALB-, and CK18-expressed cells were gone further step to be confirmed by Western blot analysis, immunofluorescence and flow cytometric analysis. Hepatocyte functional activity, including glycogen synthesis and urea production, were confirmed by periodic acid-Shiff (PAS) staining and urea assay. RESULTS:: Some epithelial-like cells or polygonal cells appeared in the directed differentiation medium within 12 days, and the number and sizes of colonies of epithelial-like cells or polygonal cells increased in the course of the cell directed differentiation. AFP, HNF-3ss, ALB and CK18 mRNA expressions first appeared within day 7, and lasted throughout the later directed differentiation. TTR, G-6-P and TAT mRNA expressions could be detected within day 14, and their expressions lasted in the course of the later directed differentiation. ALB and CK18 were confirmed to exist in the differentiated BMMCs by Western blot analysis. ALB was found in the cytoplasm and cell membrane, while CK18 scattered in the cytoplasm by immunofluorescent staining. On day 21,the ratio of ALB-positive cells was 69.45%, and the ratio of CK18-positive cells was 67.36%. The accumulation of glucogen was detected in the cytoplasm of the differentiated cells. The directed differentiated BMMCs produced urea 3 days later, and they produced urea in a time-dependent manner. CONCLUSIONS:: BMMCs could differentiate into hepatocytes or hepatocyte-like cells in the differentiation media including HGF, FGF-4, EGF, and OSM. These hepatocyte-like cells were identified at the gene level and protein level. Furthermore, these hepatocyte-like cells had some hepatocellular synthesis and metabolism functions.