Aβ寡聚体预处理的BV2细胞对PC12细胞损伤的影响及其机制

目的 研究Aβ寡聚体预处理的BV2细胞对PC12细胞损伤的影响及机制,为阿尔茨海默病(AD)的抗炎治疗提供体外实验依据.方法 分别用不同浓度Aβ1-42寡聚体(0、10 μmol/L)作用于PC12细胞作为对照组(Aβ+PC12);用相应浓度的Aβ1-42寡聚体预处理BV2细胞24 h后与PC12细胞共育作为实验组1(Aβ+BV2+PC12);不同浓度IL-1β处理PC12细胞24 h作为实验组2(IL-1β+PC12);预先用IL-1ra(50 ng/ml)孵育PC12细胞1 h后,进行实验组1的细胞培养作为实验组3[(Aβ+ BV2)+(PC12+IL-1ra)].用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β水平/浓度,用Western印迹法检测tau(pS396)、tau蛋白表达情况.结果 Aβ寡聚体预处理的BV2细胞培养液中可检测出IL-1β,Aβ寡聚体浓度的增加与IL-1β含量增加呈现一定的量效关系.PC12细胞与Aβ寡聚体预处理24 h的BV2细胞共育后(实验组1),可见PC12细胞tau(pS396)蛋白表达较对照组进一步增多(P＜0.05),此作用可被IL-1ra部分抑制(P＜0.05).结论 BV2细胞可加重Aβ寡聚体对PC12细胞损伤过程;Aβ寡聚体可诱导BV2细胞产生IL-1β,IL-1β通过tau异常磷酸化通路参与的胶质炎症反应可能是PC12细胞损伤的机制之一.     

抗Aβ42单链抗体对阿尔茨海默病小鼠脑中淀粉样沉积的改善作用

目的探讨以β淀粉样蛋白(Aβ)42为靶抗原筛选人源天然单链抗体(sc Fv)噬菌体抗体库中的特异性抗体对阿尔茨海默病(AD)模型鼠中淀粉样沉积的影响。方法以Aβ42抗原包被免疫管,对人源天然sc Fv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮吸附-洗脱-扩增淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测sc Fv的结合活性,得到一株阳性克隆sc Fv23。采用Western印迹和免疫组化的方法检测了sc Fv23与Aβ42单体、寡聚体、纤维和鼠脑中Aβ沉积的结合能力。并通过甲氮甲唑蓝(MTT)法检测sc Fv23对Aβ42寡聚体引起细胞毒性的影响,同时采用硫黄素-T荧光法(Th T-F)测定sc Fv23对Aβ42聚集形成纤维的影响。最后,通过体内实验检测了sc Fv23对AD鼠模型脑中Aβ42沉积的影响。结果通过对人源天然sc Fv噬菌体抗体库进行筛选得到一株与Aβ42具有高亲和力的克隆sc Fv23。实验发现sc Fv23可以特异性识别Aβ42寡聚体,纤维聚集体和鼠脑中Aβ42沉积,但是不能与Aβ42单体特异性结合。根据体外实验结果,sc Fv23可以有效抑制Aβ42寡聚体所诱导的细胞死亡,并且sc Fv23可以抑制Aβ42纤维聚集体的形成。体内实验结果发现,sc Fv23可以有效清除AD鼠模型中Aβ42沉积。结论通过噬菌体文库筛选得到的sc Fv23能够特异性识别脑组织中的淀粉样沉积,并且有效抑制转基因鼠中淀粉样沉积的形成。体外实验表明sc Fv23可以有效抑制Aβ42寡聚体所诱导的细胞毒性。特异性识别Aβ42的sc Fv可能会成为治疗AD的一种有效策略。     

Aβ1～42寡聚体与纤维体的制备及鉴定

目的 探讨Aβ1～42寡聚体和纤维体的制备及其鉴定方法,进而比较两者的细胞毒性.方法 设定不同的环境条件将Aβ1～42单体分别聚集成寡聚体和纤维体两种状态,利用原子力显微镜观察Aβ1 ～42的不同聚集状态.CCK-8法比较Aβ1～42寡聚体与纤维体对BV-2细胞存活率的影响.结果 原子力显微镜下观察Aβ1～42寡聚体呈球状或椭圆球状颗粒,高度为5 nm左右,Aβ1～42纤维体在镜下呈现长条纤维状聚集,高度约为3 nm左右,长度＞1 000 nm.CCK-8法显示Aβ1～42寡聚体和纤维体均对BV-2细胞具有损伤作用,并成剂量-效应关系.在同一浓度水平条件下,Aβ1～42寡聚体组的BV-2细胞存活率显著低于纤维体组(P值＜0.05).结论 原子力显微镜可直观地观察到Aβ1-42的不同聚集状态,Aβ1～42寡聚体比纤维体更具细胞毒性.     

菖蒲-远志药对组分对Aβ_(1-42)诱导PC12细胞凋亡和钙离子浓度的影响

目的观察菖蒲-远志药对组分对β-淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡和钙离子浓度的影响,探讨菖蒲-远志药对组分治疗阿尔茨海默病的作用机制。方法通过Aβ_(1-42)诱导PC12细胞建立阿尔茨海默病细胞模型,分别用α-细辛醚、远志皂苷和α-细辛醚加远志皂苷进行干预,采用AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,采用细胞流式术和钙离子荧光探针fluo3/am检测细胞内钙离子浓度,观察药物干预后各组细胞凋亡率和钙离子浓度。结果各药物干预组细胞凋亡率、钙离子浓度均下降,α-细辛醚组细胞凋亡率、钙离子浓度低于远志皂苷组,α-细辛醚组加远志皂苷组细胞凋亡率、钙离子浓度低于α-细辛醚组、远志皂苷组。结论菖蒲、远志组分具有抗神经细胞凋亡的作用,菖蒲、远志联合应用具有显著增效作用,其抗凋亡作用可能与抑制钙离子有关。     

抗Aβ抗体清除Aβ寡聚体后BV2细胞对SH-SY5Y细胞损伤的影响及机制

目的研究抗Aβ_(_(1~42))抗体清除Aβ_(1~42)寡聚体后的BV2细胞对SH-SY5Y细胞损伤的影响及机制。方法 2μmol/L Aβ_(1~42)寡聚体处理BV2细胞为激活组,2μmol/L Aβ_(1~42)寡聚体处理BV2细胞6 h后加入12μl抗Aβ_(1~42)抗体清除Aβ_(1~42)为抗体组,对照组加入等量的生理盐水,各组培养24 h。将各组收集的条件培养液分别处理SH-SY5Y细胞24 h,MTT法检测神经细胞活力。ELISA法检测BV2细胞上清液肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,Western印迹法检测磷酸化p38 MAPK的表达情况。结果抗体组对神经细胞的损伤较激活组严重(P<0.01),抗体组TNF-α的释放水平与激活组相当(P>0.05),且抗体组中磷酸化p38 MAPK蛋白仍能持续表达。结论抗Aβ抗体清除Aβ寡聚体后神经退行性变依然存在,而这种退行性变可能由p38 MAPK通路激活引起的免疫炎症介导。     

晚期糖化终产物对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡作用机制的实验研究

目的 研究AGEs对Aβ诱导的PC12细胞的作用机制是否与氧化应激有关，阻断RAGE活性能否作为有效的作用靶点。方法 Aβ诱导PC12细胞后加入低、中、高浓度AGEs孵育12h；胰蛋白酶处理PC12细胞后加入Aβ，MTT法检测细胞活力，流式细胞仪测定细胞凋亡，RT-PER法测定RAGE，NF-κB表达。结果 MTT法显示随AGEs浓度升高，细胞活力下降，胰蛋白酶处理组细胞活力升高，流式细胞仪检测显示随AGEs浓度增加，细胞凋亡率增加，RT-PCR法半定量分析RAGE、NF-κB达随AGEs浓度升高而增高。结论 AGEs对Aβ诱导的PC12细胞神经毒性损害由RAGE介导．并与RAGE引起NF-κB达有关，阻断RAGE可减低其神经毒性，阻断RAGE活性可作为有效的药物作用靶点。     

Aβ1-40诱导PC12细胞神经突触改变的ERK信号转导机制的初步实验研究

目的 探讨ERK信号转导通路在β淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）诱导神经突触损伤中的可能作用机制.方法 星形胶质细胞诱导PC12细胞分化为神经元样细胞,然后随机分为两组：对照组和Aβ1-40组,分别作用不同时间段.应用扫描电镜观察突触数目,透射电镜观察神经突触超微结构,免疫荧光技术检测突触素、生长相关蛋白-43（GAP-43）表达,Western blot检测ERK蛋白表达.结果 Aβ1-40作用PC12细胞4 h时,突触囊泡数目明显减少,突触间隙模糊,突触数目明显减少,突触素和GAP-43表达也明显减少,磷酸化ERK（p-ERK）明显减少,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 Aβ1-40可以诱导PC12细胞神经突触毒性损伤,而且ERK信号转导通路的激活受到抑制,因而推测Aβ1-40诱导PC12细胞神经突触毒性损伤机制与ERK信号转导通路活化受到抑制有关,这可能是AD早期神经突触损伤机制之一.     

补肾中药对SHR血管内皮舒缩因子的影响

目的 观察补肾阴中药女贞子和补肾阳中药淫羊藿对自发性高血压大鼠(SHR)血管内皮舒缩因子的影响.方法 采用随机对照研究方法将40只12周龄～14周龄SHR随机分为女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组、空白组,以同龄同种系正常血压的京都种大鼠(WKY)10只作为正常组.女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组分别给予女贞子、淫羊藿水煎液,依那普利水溶液,空白组和正常对照组给予蒸馏水.连续给药两周后,用多导生理仪经颈动脉穿刺至左心室瓣口测量各组大鼠的血压值,并取腹主动脉血测定血清一氧化氮(NO)、血浆6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、内皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)含量.结果 用药前后女贞子组、淫羊藿组与空白组比较收缩压值无统计学意义,但用药后女贞子组的NO、6-Keto-PGF1α与空白组比较显著增加(P<0.05或P<0.01),ET、TXB2与空白组比较明显降低(P<0.01).结论 补肾中药能增加血管内皮舒张因子,减少血管内皮收缩因子ET、TXA2补肾中药可通过调节血管内皮舒缩因子的分泌,改善血管内皮功能,以减轻血压增高引起的血管内皮功能障碍.     

Fyn信号通路参与β-淀粉样蛋白对大鼠皮层神经元的毒性损伤作用

目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养皮层神经元的毒性损伤以及Fyn信号转导通路在此过程中的作用。方法孕17～18 dSD大鼠,体外分离培养皮层神经元,培养7 d后加入Aβ1～42,孵育8 h建立毒性损伤模型,采用生化方法检测神经元细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)释放率,以免疫荧光法、Western印迹法分别检测Fyn和Fak的表达情况。结果与对照组比较,经终浓度5μmol/L的寡聚体Aβ1～42诱导损伤8 h,神经元细胞培养上清中的LDH释放增加,免疫荧光和Western印迹法分别检测到Fyn和Fak的表达增加。结论 A可明显诱导原代培养皮层神经元的毒性损伤,Fyn信号通路参与这一毒性损伤作用。     

淫羊藿提取物干预阿尔茨海默病病理发生机制的作用

<正>淫羊藿是小檗科淫羊藿属多年生草本植物,始载于《神农本草经》,是安神、健脑、补肾、治疗脑疾病的首选药材。经实验证明,淫羊藿提取物具有抗氧化应激、减轻炎症反应、调节神经递质、减少淀粉样蛋白(Aβ)生成、抑制神经细胞凋亡及改善阿尔茨海默病(AD)患者的认知功能等多种神经生物学功能[1]。本文就淫羊藿提取物有效成分对AD的病理发生机制的可能作用做一综述。1化学成分研究淫羊藿中含有多种具有生理活性的化学成分。淫羊藿属     

女贞子、淫羊藿补肾中药对自发性高血压大鼠主动脉内皮舒缩功能的影响

目的 研究补肾中药女贞子、淫羊藿对自发性高血压大鼠(SHR)的血压、主动脉内皮舒张因子一氧化氮(NO)及收缩因子内皮素(ET-1)的影响,探讨补肾中药调节主动脉内皮舒缩功能的可能机制.方法 采用随机对照研究的方法将40只12~14周龄自发性高血压大鼠(SHR)随机分为女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组、模型组,以同龄同种系正常血压的京都种大鼠(Wistar-Kyoto rat,WKY)10只作为正常组;女贞子组、淫羊藿组、阳性对照组分别给予女贞子、淫羊藿水煎液,依那普利水溶液,模型组和正常组给予蒸馏水灌胃.2 w后采用多导生理记录仪检测大鼠血压,处死大鼠后取腹主动脉血测定血清一氧化氮(NO),血浆内皮素-1(ET-1)的含量,取主动脉检测内皮eNOS、ET-1蛋白及eNOS mRNA、ET-1mRNA的表达.结果 用药后女贞子、淫羊藿使SHR大鼠的血压有所降低,但差异无统计学意义;女贞子组、淫羊藿组血液NO、主动脉内皮eNOS蛋白及eNOS mRNA表达较模型组升高(P<0.05),血液ET、主动脉内皮ET-1蛋白及ET-1 mRNA表达均明显降低(P<0.05).结论 单味中药女贞子、淫羊藿虽然没有明显降低血压,但略有下降的趋势,且能调节主动脉血管内皮舒缩因子.     

淫羊藿提取物对犬急性心肌缺血的保护作用

目的观察淫羊藿提取物对犬急性心肌缺血的保护作用。方法取杂种犬24只,随机分为4组(每组6只),分别为生理盐水对照组,阳性对照药物(地奥心血康胶囊)组,52.0 mg/kg淫羊藿提取物组和104.0 mg/kg淫羊藿提取物组;采用结扎麻醉,犬开胸后结扎左冠状动脉前降支制备实验性急性心肌缺血模型,观察淫羊藿提取物对心外膜电图、心肌梗死面积和血清酶的影响。结果淫羊藿提取物减少缺血程度,降低缺血范围,缩小缺血心肌的梗死面积,降低血清中磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶的活性,降低血清中游离脂肪酸、过氧化脂质含量,提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物活性。结论淫羊藿提取物对实验性心肌缺血犬心肌产生保护作用。     

黄连素抑制JNK激酶活性缓解Aβ_(1～42)诱导的细胞凋亡

目的探讨黄连素(BR)能否缓解Aβ1~42诱导的细胞凋亡及其可能机制。方法在人胚肾细胞-293(HEK293)稳定转染转Aβ前体蛋白(APP)的细胞系(HEK293/APP)中给予不同浓度聚集状Aβ1~42处理,研究Aβ1~42的细胞毒性。HEK293/APP细胞预先给予20μg/ml的黄连素24 h处理后给予Aβ1~42处理12 h。通过CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western印迹检测蛋白变化。结果 BR能够显著改善HEK293/APP细胞由Aβ1~42所诱导的细胞毒性和凋亡(P0.05),抑制JNK和Caspase-3的激活(P0.05)。结论 BR能够缓解Aβ1~42诱导的凋亡,其可能机制是通过抑制JNK激活进而抑制Caspase-3的活化来对抗凋亡。     

远志皂苷元对Aβ1-42诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响

目的:观察远志皂苷元(TEN)对阿尔茨海默病体外模型β-淀粉样蛋白1-42(Aβ_1-42)诱导PC12细胞凋亡和自噬的影响。方法:体外培养PC12细胞,并随机分为对照组(正常生长PC12细胞)、模型组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤)以及TEN低、中、高剂量组(Aβ_1-42诱导PC12细胞损伤+TEN低、中、高剂量)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白和自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果:与对照组比较,模型组细胞活力明显下降(P<0.01),p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01),Caspase-3、Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,TEN各剂量组神经元存活率升高,p-...     

上调糖皮质诱导型蛋白激酶-1能够保护Aβ1～42诱导的细胞凋亡

目的探讨上调糖皮质诱导型蛋白激酶(SGK-1)能否保护Aβ1～42诱导的细胞毒性及其保护机制。方法在HEK293细胞中给予不同浓度Aβ1～42聚集体处理,摸索合适的诱导细胞毒性的浓度。HEK293细胞转染SGK-1质粒24 h后再给予Aβ1～42处理24 h,通过细胞活性分析以及Western印迹实验检测凋亡相关通路变化。结果过表达SGK-1能够明显改善HEK293细胞由Aβ1～42诱导的细胞毒性(P<0.05),SGK-1的上调伴随着JNK-1(P<0.01)和Caspase-3的抑制(P<0.05)。结论上调SGK-1可能通过抑制JNK-1的激活从而抑制Caspase-3的活化来保护细胞,上调SGK-1可以作为治疗阿尔茨海默病(AD)患者Aβ细胞毒性的保护靶点。     

葛根素对Aβ25-35诱导的PC-12细胞损伤的保护作用

目的研究葛根素对阿尔茨海默病(AD)的保护作用。方法实验分正常组、模型组、葛根素保护组。体外培养大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC-12),以不同浓度诱导PC-12细胞建立AD的细胞模型,观察葛根素对细胞活力、凋亡、异常磷酸化的tau蛋白的影响。结果不同浓度的β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)作用于PC-12细胞后,选用10μmol/L的Aβ25-35作用于PC-12细胞24h建立AD细胞模型,MTT法检测细胞存活率发现葛根素保护组较模型组明显升高,TUNEL法检测凋亡发现阳性细胞葛根素保护组明显少于模型组,P-tau抗体检测异常磷酸化的tau蛋白发现阳性细胞葛根素保护组明显少于模型组,均具有统计学意义。结论葛根素对AD具有保护作用。     

ICAM-5对Aβ神经毒性的保护作用

目的 观察在缺氧条件下,Aβ下预人神经母细胞瘤细胞株(PAJU-ICAM-5细胞及PAJU-NEO细胞)后细胞株凋亡的情况,探讨缺氧环境中ICAM-5对Aβ神经毒性作用有无影响.方法 将人神经母细胞瘤细胞分为常态组、Aβ干预组、缺氧组、缺氧+Aβ 干预组.用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化、MTT法观察细胞凋亡的情况.结果 倒置相差显微镜下观察:PAJU-ICAM-5 及 PAJU-NEO细胞中缺氧组、Aβ组、缺氧并Aβ干预组较常态组细胞突起变短、减少,PAJU-ICAM-5细胞突起的长度较PAJU-NEO细胞的突起长.MTT染色:PAJU-ICAM-5细胞及PAJU-NEO细胞中缺氧组及Aβ组的细胞存活率较常态组降低(P＜0.05),缺氧并Aβ干预组的细胞活性较常态组明显降低(P＜0.01),缺氧组与A3组比较,其存活率无显著变化(P＞0.05).结论 Aβ42能引起PAJU细胞的凋亡,缺氧能促进其凋亡;ICAM-5可以减轻Aβ42的神经毒性作用.     

β淀粉样蛋白1～42促进U87细胞凋亡作用的研究

目的研究重组人β淀粉样蛋白(Aβ)1~42对人神经胶质瘤细胞U87毒性作用机制。方法用MTT检测代谢率,倒置显微镜、投射电镜以及流式细胞术技术研究Aβ1~42对U87细胞的损伤作用机制。结果用Aβ1~42处理U87细胞24 h后,Aβ1~42剂量依赖性地引起U87细胞的MTT代谢率减少。倒置显微镜及透射电镜观察发现经Aβ1~42处理的U87细胞表现出凋亡细胞的特征。流式细胞仪检测表明10、20、50μmol/L的Aβ1~42组U87细胞的凋亡率分别为35.6%,42.2%,58.1%。结论 Aβ1~42致U87细胞发生损伤主要是通过细胞凋亡的途径。     

国家中药复方专利治疗血管性痴呆的用药规律研究

目的:基于数据挖掘技术研究国家专利数据库中治疗血管性痴呆(VD)的中药复方配伍规律,为VD的临床治疗及新药研发提供思路。方法:检索国家知识产权局中国专利公布公告网站建库至2022年5月1日治疗VD的中药复方专利数据,运用古今医案云平台(V2.3.5)对筛选出的中药复方进行药物频次统计、性味归经统计、功效统计、关联分析、聚类分析、复杂网络分析等数据挖掘。结果:通过检索与筛选,共纳入符合标准的中药复方67首,涉及197味中药,药物总频次548次。药物使用频次居前10位的分别是川芎、石菖蒲、丹参、黄芪、三七、人参、当归、天麻、淫羊藿、远志。药物性味归经方面,药性以温性为主,其次为平性、寒性等;药味以甘味为主,其次为苦味、辛味等;归经以肝经为主,其次为心经、脾经、肺经、肾经等。药物功效以润肠通便、滋阴养血、强筋壮骨、祛风止痛、安神益智、活血祛瘀等使用频次较高。药物关联中高频药物组合有“川芎→黄芪”“黄芪→石菖蒲”“丹参→石菖蒲”“丹参→川芎”“远志→石菖蒲”等。药物聚类可将使用频次≥8次的18味高频中药聚类成6类。复杂网络分析筛选出治疗VD的核心组方为黄芪、川芎、丹参、三七、石菖蒲、远志、熟地...     

Aβ42介导的阿尔茨海默病对小脑AMPA受体GluR2亚基及caspase-3表达的影响

目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)42介导的神经毒性对小脑2-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体(AMPAR)谷氨酸受体(GluR)2亚基及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3蛋白和基因表达的影响。方法 Aβ42 5μl侧脑室注射制备阿尔茨海默病(AD)动物模型,利用水迷宫实验筛选入组SD大鼠。17 d后取材,将大鼠随机分为对照组(侧脑室注射5μl生理盐水)和Aβ42组,采用免疫组化染色、Western印迹和RT-PCR方法检测小脑AMPAR的GluR2亚基及caspase-3蛋白和基因的表达。结果 Aβ42组穿越平台次数显著低于对照组(P0.05)。Aβ42组GluR2亚基表达量及基因水平明显低于对照组(P0.05),而caspase-3表达量及基因水平明显高于对照组(P0.05)。结论 Aβ42介导的神经毒性影响小脑AMPAR的GluR2亚基及caspase-3的表达,AMPAR通过caspase-3参与AD大鼠小脑中由Aβ42介导的神经毒性作用。