脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠神经营养因子表达的影响

目的 观察脑脉通对脑缺血再灌注大鼠移植BMSCs后神经营养因子表达变化的影响.方法 体外培养和扩增BMSCs;线栓法制备脑缺血模型;大鼠脑缺血再灌注后24h颈内动脉移植BMSCs;免疫组织化学法测定BMSCs移植后7d(早期)、14 d(中期)和28 d(后期)神经细胞特异性标志NSE和GFAP、神经营养因子NGF和GDNF表达变化.结果 假手术组大鼠NSE和GFAP表达明显.脑缺血后7d、14d、18d组NSE表达减弱;7d组GFAP表达增强、14d和28d减弱;7d组NGF表达增强、14d和28d组递减;7d组GDNF表达增强、14d减弱、28d增强.脑脉通7d组大鼠的NSE表达较模型组增强;28d组GFAP表达减弱;14d和28d组NGF表达增强;7d组GDNF表达减弱,14d组增强.移植28d组GFAP,NGF和GDNF表达均较模型组增强.与移植组比较,联合7d组和28d组NSE表达增强;7d组GFAP表达减弱,14d增强;28d组NGF表达增强.结论 脑缺血再灌注后神经元细胞反应、神经营养因子NGF和GDNF表达呈不同变化特点;BMSCs移植后早期作用并不显著,但后期增强神经营养因子表达及神经细胞反应的作用明显;脑脉通可使BMSCs移植保护神经细胞的作用提前并增强,其作用机制可能与早期上调NGF和GDNF表达有关.     

电针对糖尿病周围神经病大鼠坐骨神经 Nrg1和 ErbB2表达的影响

目的：探讨电针对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病周围神经病（ DPN）模型坐骨神经中神经调节蛋白1（Nrg1）和表皮生长因子受体2（ErbB2）表达的影响。方法：大鼠随机分为正常组、模型组、普通针刺组、电针组。链脲佐菌素腹腔注射制备实验DPN大鼠模型,造模后14天检测各组血糖及坐骨神经传导速度,实时荧光定量PCR检测坐骨神经Nrg1和ErbB2 mRNA表达。结果：与正常组比较,模型组、电针组和普通针刺组血糖显著增高（P＜0．01）。与模型组比较,电针组和普通针刺组神经传导速度显著增高（P＜0．01）,坐骨神经Nrg1和ErbB2 mRNA表达显著上调（P＜0．01）,其中电针组治疗效果优于普通针刺组（P＜0．05）。结论：电针可通过上调糖尿病周围神经病坐骨神经Nrg1和ErbB2 mRNA表达,促进施万细胞生存,改善糖尿病周围神经病坐骨神经功能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索体外分离培养及纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)的方法.方法:采用贴壁分离和消化控制相结合的方法,分离纯化3～4周龄大鼠MSCs,免疫细胞化学法鉴定其活性和表型.结果:原代培养的MSCs呈圆形、梭形、多角形等,24 h内即可见少量细胞体贴壁伸展,7～8 d左右可达90%融合,纯化后的MSCs呈均匀一致的长梭形,24h内细胞贴壁率99%,传代周期为7d左右.免疫细胞化学检测显示CD34表达阴性,CD44表达阳性.结论:贴壁分离和消化控制相结合能有效分离纯化成年大鼠MSCs,细胞纯度较高,细胞活力强,生物学性状稳定,是目前一种比较理想的分离纯化方法.     

骨髓间充质干细胞穴位移植对痴呆大鼠内源性神经干细胞增殖分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSC)风府穴穴位移植对痴呆大鼠海马区内源性神经干细胞增殖、分化的影响。方法 SD大鼠50只,随机抽取10只作为对照组,其余采用Aβ1-42寡聚体侧脑室灌注建立大鼠阿尔茨海默病模型,然后再随机分为模型组、风府穴组、足三里穴组、尾静脉组,每组10只。水迷宫检测造模成功进行相应干预,风府穴组及足三里组分别以大鼠BMSC穴位移植,尾静脉组移植等量BMSC,模型组于风府穴注射等量的生理盐水,对照组作为空白对照。4周后,水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力,免疫荧光检测大鼠海马区内源性Nestin﹢、β-Tubulin-Ⅲ﹢表达。结果造模后水迷宫检测大鼠逃避潜伏期(EL)较对照组延长(P0.01),穿越平台次数显著减少(P0.001)。干预后,与模型组比较,风府穴组EL无明显缩短(P0.05),穿越平台次数无明显增加(P0.05)。Nestin﹢细胞数升高(P0.05),β-Tubulin-Ⅲ﹢细胞数无明显增加(P0.05)。结论大鼠BMSC风府穴穴位移植能诱导AD大鼠海马区内源性神经干细胞增殖,但尚未证实向成熟神经细胞定向分化。     

电针对酒精中毒性周围神经病大鼠NGFmRNA表达的影响

目的:通过酒精自由饮建立慢性酒精中毒性大鼠周围神经病变模型,酶联免疫的手段和方法,从细胞分子生物学等不同层面探讨电针对慢性酒精中毒型周围神经病的治疗作用机制,发挥针灸治疗优势,为针灸治疗慢性酒精中毒性周围神经病的临床推广提供新的理论依据。方法:造模后的成年雄性Wistar大鼠50只,随机分成空白对照组、模型组、弥可保对照组、电针组、普通针刺组,每组各10只。各组按相应的方法进行治疗。结果:正常坐骨神经的NGFmRNA表达量极低,酒精中毒损伤后坐骨神经NGFmRNA表达增高,治疗2周达到一个小的高峰;2~4周NGFmRNA的表达出现一轻度回落趋势,但4周后又继续升高。针刺治疗后,治疗组的NGFmRNA表达较模型组均有不同程度升高,其中电针组升高幅度最为明显,始终处于高水平。结论:电针可升高酒精中毒性大鼠坐骨神经中NGFmRNA的含量。     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞SDF-1表达的影响

目的:研究川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞(MMSCs)表达趋化因子SDF-1的影响。方法:收集SD大鼠的股骨、胫骨骨髓内的细胞进行体外培养,取第3代细胞用于实验。用含不同浓度的川芎嗪低糖培养液培养MMSCs,用RT-PCR法检测培养1d、3d、5d、7d MMSCs的SDF-1mRNA的表达。结果:培养1d后,未诱导的MMSCs和5-氮胞苷诱导后SDF-1mRNA均未出现明显表达,但随着培养时间的延长,SDF-1的表达逐渐增强。0.08mmol/L和1.28mmol/L浓度的川芎嗪在干预1d后,MMSCs上的SDF-1已出现表达,干预3d后不同浓度的川芎嗪可明显加快SDF-1的表达,干预第5d和第7天后,0.08mmol/L川芎嗪组促SDF-1的表达作用要高于其他诱导组。结论:川芎嗪可促进大鼠骨髓间充质干细胞SDF-1mRNA表达,有助于促进MMSCs向心梗局部的归巢。     

电针对糖尿病周围神经病模型大鼠血清和坐骨神经SOD、MDA影响的研究

目的：探讨电针对糖尿病周围神经病变模型大鼠氧化应激水平的影响。方法：本课题采用体重在200g左右的雄性Wistar大鼠,以链脲佐菌素链脲估菌素左下腹单次注射诱导形成糖尿病模型,造模后选血糖≥16．7mmol／L的Wistar大鼠喂养8周制成DPN模型。随机分为模型对照组、普通针刺组、电针组,另设正常组,每组8例,共32例。普针组选用肝俞、脾俞、肾俞、后三里、环跳、阳陵泉等穴位进行针刺;电针组取相同穴位,进针后快速捻转1min后,接KWD-80811脉冲电疗仪,肾俞、后三里接1对导线,正极在上,负极在下,采用疏密波,电流量以大鼠肢体肌肉轻度收缩为度。以上两组每穴治疗20min,隔日1次,共治疗8周。通过对大鼠一般情况、血糖、体重的监测,结合神经电生理方法检测神经传导速度,评价电针对DPN的治疗效应。采用邻苯三酚自氧化抑制法测血清和坐骨神经中超氧化物歧化酶（SOD）;采用硫代巴比妥荧光法测血清和坐骨神经中丙二醛（MDA）。结果：治疗8周后,电针和普针组大鼠血糖水平明显低于模型组（P〈0．01）,感觉神经传导速度（SNCV）明显快于模型组（P〈0．01）,普针组和电针组大鼠血清和坐骨神经中SOD含量比模型组明显升高（P〈0．01）,MDA水平显著降低（P〈0．01）,而电针组相对于普针组效果更加明显（P〈0．01）。结论：电针能有效改善DPN模型大鼠周围神经病变症状、体征;电针能更好地改善大鼠的抗氧化能力和抑制大鼠机体内的活性氧损伤。     

糖尿病周围神经病的神经电生理检测意义

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的并发症之一,由于合并神经病变时常起病隐袭,无明显自觉症状,给早期诊断造成一定困难.现回顾性分析本院2003年5月-2005年5月诊治的200例糖尿病患者的神经电生理检查结果,探讨神经电生理检查诊断糖尿病早期周围神经病变的敏感指标及其与病程的关系.     

骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子联合移植对大鼠创伤性脑损伤修复的研究

目的探讨联合移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）和血管内皮生长因子（VEGF）对创伤性脑损伤（TBI）大鼠脑组织中脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响。方法 SD大鼠2只,取股骨骨髓体外培养BMSCs。SD大鼠40只,随机分为单独移植BMSCs组、单独应用VEGF组、联合移植BMSCs与VEGF组及对照组,每组10只。采用改良的Feeny自由落体撞击方法建造中度创伤性脑损伤模型。造模后1周,在立体定向仪下分别将等量BMSCs、VEGF、BMSCs加VEGF及PBS液注入相应大鼠的损伤脑组织周边。养育2周后处死取脑。采用HE及尼氏染色法观察脑组织病理学变化;采用免疫组化染色,应用Image pro-Plus6.0软件测量半暗带及健侧对称部位BDNF阳性表达区域的总和累积光密度,应用SPSS 11.3软件进行统计学分析。结果除BMSCs组外,其余各组对称部位BDNF含量均较半暗带高（P〈0.05）;联合移植组半暗带的BDNF含量明显高于对照组（P〈0.05）。结论联合移植BMSCs与VEGF可有效抑制TBI大鼠半暗带中BDNF含量的降低,有利于神经功能的恢复。     

黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的特性

目的观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响,为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝(MTT)法筛选出黄芪多糖的合适浓度,取F3代细胞,采用随机数字表法分为对照组和诱导组(神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导),采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脂蛋白酯酶(LPL)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示,在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显,甲苯胺蓝染色阳性,而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达,LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞,而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞长期诱导效应的研究

目的 探讨川芎嗪提取液体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的长期诱导效应.方法 分离培养大鼠骨髓MSCs,用1.50g/L川芎嗪提取液对MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化,并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达.结果 川芎嗪诱导培养8h后即可见细胞形态发生变化,24 h后表现为典型的神经元细胞形态,Nestin和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达,3d后诱导效果最好,6d后,有些细胞突起变长,出现分叉,并且有些细胞出现衰老死亡.结论 川芎嗪早期诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果较好,长期诱导的特异性不明显.但可促进细胞突起的生长,并且促进神经细胞的成熟和死亡.     

黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导MSCs分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨黄芪甲苷(AST)与5-氮胞苷(5-aza)联合应用对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的影响。方法采用贴壁培养法分离大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD34和CD44。分组诱导培养4周:I组(空白对照组)、II组(100 mg/L AST+5μmol/L 5-aza)、III组(10μmol/L 5-aza)、IV组(5μmol/L 5-aza)。利用免疫荧光法对诱导后细胞进行鉴定,观察心肌特异性结构蛋白cTnT、Desmin的表达,计算诱导分化率。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测诱导后MSCs中心钠素(ANP)mRNA的表达水平;以ELISA法检测诱导后细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的水平。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD34阴性,CD44阳性;药物诱导后细胞形态发生显著变化,AST联合5-aza诱导能高效表达心肌特异性蛋白cTnT、Desmin,诱导分化率别为8.33%,18.00%。提高ANP mRNA的表达水平,亦能显著增加诱导后细胞内cAMP的含量。其作用效果与5μmol/L 5-aza诱导组比较,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),与10μmol/L 5-aza诱导组作用效果相当(P>0.05)。结论黄芪甲苷联合5-氮胞苷能在体外成功诱导MSCs分化为心肌样细胞,可使5-aza最佳诱导浓度从10μmol/L降至5μmol/L,而诱导效果不变。AST联合5-aza诱导后细胞与正常心肌细胞不仅形似,更具备相似的生理功能。     

养心通脉有效部位方对MSCs向心肌样细胞分化的影响

目的观察养心通脉有效部位方对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化为心肌样细胞的诱导作用。方法体外培养大鼠MSCs,设养心通脉有效部位方(YTF)组、5-氮胞苷(5-aza)阳性对照组和低糖DMEM组,体外诱导分化心肌样细胞;用免疫细胞化学方法观测其心肌肌丝蛋白(Desmin)、肌球蛋白重链(MHC)的表达,用RT-PCR的方法检测心肌转录因子GATA-4 mRNA的表达。结果大鼠MSCs体外向心肌样细胞分化诱导后,在DMEM组中未发现Desmin和MHC阳性细胞;而YTF组和5-aza组的Desmin及MHC免疫组化染色均可见阳性免疫复合物,与DMEM组比较,YTF组和5-aza组Desmin、MHC、GATA-4 mRNA表达的相对光密度(IOD)值均明显提高(P<0.01,P<0.05),而且YTF组Desmin、MHC的IOD也明显高于5-aza组(P<0.05),但YTF组GATA-4 mRNA的IOD值与5-aza组比较无统计学差异。结论 YTF在体外可诱导MSCs向心肌样细胞分化。     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的观察补肾活血中药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系;收集补肾活血中药的含药血清,用10%含药血清代替10%的血清,绘制生长曲线,观察补肾活血中药含药血清促进骨髓间充质干细胞体外增殖的作用。结果所培养的大鼠骨髓细胞在表型表达和细胞形态上具备MSC特征,补肾活血中药含药血清组增长速度比空白对照组明显加快,并与剂量呈正比。结论补肾活血中药含药血清能促进干细胞在体外增殖。     

补肾生血药对顺铂损伤的小鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的：观察补肾生血药对顺铂损伤的骨髓间充质干细胞（BMSC）的影响,探讨补肾生血改善化疗后骨髓抑制的机制。方法：将50只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、补肾生血药组,每组25只,分别制备补肾生血血清和空白血清,原代培养BALB/c小鼠BMSC,随机分组,CCK-8法确定顺铂和补肾生血血清干预浓度。干预48 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期,酶联免疫吸附试验法检测培养液中造血调控因子含量。结果：干预48 h后,骨髓细胞凋亡率明显增高（P<0.01）,补肾生血血清组G1期细胞比例显著降低（P<0.05）,S期细胞比例显著增加（P<0.05）,增殖期细胞比例明显增加（P<0.05）。补肾生血血清组骨髓细胞凋亡率明显降低（P<0.001）,G1期细胞比例显著降低（P<0.05）,增殖期细胞比例显著增加（P<0.05）,IL-3含量明显升高（P<0.01）,TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量显著降低（均P<0.05）。结论：补肾生血药能减轻顺铂造成的BMSC凋亡,促进细胞进入增殖期,促进造血生长因子分泌,减少造血抑制因子分泌,提示该药对化疗后骨髓抑制具有一定的改善作用。     

温阳补肾药对骨髓间充质干细胞促增殖的实验研究

目的：观察、比较巴戟天、鹿角胶、淫羊藿、骨碎补对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）促增殖的影响,探讨其作用机理。方法：建立SD大鼠BMSCs体外培养体系,倒置显微镜、苏木精-伊红染色进行形态学观察;流式细胞仪（FCM）进行BMSCs细胞周期分析;MTT法检测BMSCs生长曲线;4味温阳补肾药含药血清配制,确定其最佳药物浓度和最佳血清浓度对BMSCs促增殖的影响。结果：体外培养大鼠BMSCs经倒置显微镜、苏木精-伊红染色的形态学观察均符合BMSCs的形态及生长特点。高、中、低剂量的四味中药含药血清对F3BMSCs 24、48、72h的增殖效应显示,以中剂量组20%含药血清对F3BMSCs 48h后促增殖最明显,其组间比较结果为淫羊藿〉骨碎补〉鹿角胶〉巴戟天。结论：巴戟天、鹿角胶、淫羊藿、骨碎补四味温阳补肾药均有促BMSCs增殖作用。淫羊藿促BMSCs增殖效果最佳,其组间比较结果为淫羊藿〉骨碎补〉鹿角胶〉巴戟天。     

股骨头坏死愈胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用

目的:观察股骨头坏死愈胶囊含药血清对体外大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的保护作用。方法:在体外分离、筛选、培养大鼠BMSCs细胞,制备0.36,0.72,1.44 g·kg-1灌胃处理得到的股骨头坏死愈胶囊含药血清作用后,选择第3代大鼠BMSCs,实验分为空白组(加入不含大鼠血清的培养液),正常组(加入体积分数为20%正常大鼠血清培养液),模型组(加入体积分数为20%正常大鼠血清培养液和全反式维甲酸诱导细胞凋亡)和中药血清低、中、高剂量组(培养过程中分别加入对应剂量、体积分数为20%的股骨头坏死愈胶囊含药血清培养液和全反式维甲酸诱导细胞凋亡),共6组,MTT法检测各组细胞相对存活率,流式细胞仪检测各组细胞周期,进行比较。结果:与正常组比较,模型组,中药血清低、中、高剂量组相对存活率下降,细胞周期中G1期比例上升,G2及S期比例下降,差异有显著性意义(P0.01)。与模型组比较,中药血清低、中、高剂量组相对存活率上升,G1期比例减少,G2及S期比例增加,且随着中药剂量增加而差值明显,差异有显著性意义(P0.01)。结论:股骨头坏死愈胶囊含药血清可提高大鼠BMSCs的存活率,对全反式维甲酸所致的细胞凋亡有保护作用。     

脑心通联合弥可保治疗糖尿病周围神经病变疗效观察

目的观察脑心通胶囊联合弥可保治疗糖尿病周围神经病变的临床疗效。方法选择90例糖尿病合并周围神经病变患者,随机分成两组,治疗组47例,口服脑心通胶囊3粒／次,3次／天,同时应用弥可保500μg,肌肉注射,1次／天,连续4周。对照组43例用弥可保500μg,肌肉注射,1次／天,连续4周。结果治疗4周后两组神经症状与检查评分均明显下降,但以治疗组下降显著,治疗后两组评分差异有统计学意义（P〈0．01）。结论脑心通胶囊联合弥可保治疗糖尿病周围神经病变有较好疗效。     

中药麦冬对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的诱导作用研究

目的研究为证明浙麦冬可能具有MSCs诱导作用,且其补心阴作用与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells,MSCs)转化率成正比。且阐明浙麦冬对MSCs的诱导作用和机制。方法(1)流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标记分子CD73,CD90,CD45,CD34,观察药物对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞形态结构的影响。(2)免疫荧光法检测浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnI和CX43蛋白表达情况。(3)qPCR法检测MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx 2.5,GATA4和β-MHC mRNA表达情况。结果(1)与空白对照组比较,给药组的心肌样细胞中肌钙蛋白I(CTnI)和连接蛋白43(CX43)的表达量明显增加,而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。(2)与空白对照组比较,给药组的心肌样细胞中NKx 2.5,GATA4和β-MHC mRNA相对表达量明显增加,而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。(3)与空白对照组比较,给药组的MSCs中在1周左右存活的部分细胞体积逐渐增大,呈球状、棒状或长梭形;2周以后细胞间出现连接,排列方向渐趋一致。结论补心阴中药浙麦冬能诱导MSCs分化形成心肌样细胞,而且呈现剂量依赖性。