嗜肺军团菌分子生物学检测及流行病学分型方法

军团菌病主要由嗜肺军团菌引起。与传统的军团菌检测方法相比，分子生物学检测技术灵敏度高、特异性强、快速有效。分子分型对军团菌流行病学调查及监控具有非常重要的意义。本文对嗜肺军团菌分子生物学检测及流行病学分型方法作一综述。     

应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌

目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求.     

应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌

目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求.     

深圳市中央空调冷却塔军团菌核糖体基因型研究

军团病(Legionnaires' disease)是由军团菌感染引起的以肺炎为主要症状的急性呼吸道传染病,嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,Lp)是引起军团病的主要菌群。目前研究发现军团菌广泛存在于自然界的土壤和各种水环境中,中央空调冷却塔是军团菌主要的传染源,近30年来军团病大的暴发多与中央空调冷却塔被军团菌污染有关。     

延安市286例呼吸科患者血清嗜肺军团菌抗体的检测

目的了解延安市嗜肺军团菌的感染情况。方法采用微量凝集法对286份呼吸科住院患者血清标本进行嗜肺军团菌Lp1型军团菌抗体测定。结果抗体阳性率为17．13％,其中男为18．56％,女为15．13％;在各年龄组均有嗜肺军团菌Lp1型抗体阳性者,其中40岁年龄组的感染率（26．09％）最高;呼吸科疾病中肺结核患者合并嗜肺军团菌Lp1感染率较高,为26．56％,各疾病类型之间感染率比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论延安市存在一定的嗜肺军团菌感染,需加强对军团病血清学的监测工作。     

PCR检测嗜肺军团菌的应用研究

ＰＣＲ检测嗜肺军团菌的应用研究李崇辉，杨瑞馥．李银太，郭兆彪，周方，高树德嗜肺军团菌（ＬＰ）是引起军团病的主要病原菌。作者将建立的用ＰＣＲ检测ＬＰ的方法，应用于环境水和临床标本中ＬＰ的检测，并建立了简便快速实用的标本处理方法。首先以环境水中的常见细菌...     

实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究

目的 建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具.方法 在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性.结果 当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmol/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA 6.0μl,反应条件为预变95℃20 S,变性95℃10 s,退火50℃ 40 s,40个循环时,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝/μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23～16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5 h.结论 TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测.     

沉默HDAC6对嗜肺军团菌干扰RAW264.7自噬作用的影响

目的 以嗜肺军团菌感染HDAC6基因沉默的RAW264.7细胞为研究对象,检测自噬流及自噬相关因子表达水平的变化,探究HDAC6在嗜肺军团菌干扰巨噬细胞自噬中的作用机制。方法 利用RNAi技术介导基因沉默,构建shRNAHDAC6细胞,Western blot验证沉默效果。用嗜肺军团菌活菌和灭活菌[感染复数(MOI)=50]分别感染RAW264.7、sh-NC、shRNA-HDAC6细胞6、12、24 h。应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化;透射电镜观察嗜肺军团菌感染24 h后各组细胞内的自噬小体和自噬溶酶体;实时荧光定量PCR及Western blot法检测AMBRA1、ATG9B、P62、Beclin1、α-tubulin、LC3B的表达水平。结果 与RAW264.7对照组相比,shRNA-HDAC6细胞的HDAC6蛋白表达水平显著降低(P<0.05);自噬双标质粒检测自噬流结果显示,嗜肺军团菌活菌及灭活菌感染RAW264.7细胞,自噬流均减弱,沉默HDAC6后嗜肺军团菌感染巨噬细胞自噬流增加。透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染巨噬...     

嗜肺军团菌mip基因联合疫苗诱导的小鼠免疫应答

<正>军团病主要由嗜肺军团菌引起,嗜肺军团菌共有15个血清型,其中血清1型在人军团菌病中最常见,约占80%[1],可引起严重肺炎[2]。军团菌污染的水源通过加湿器、喷雾器、淋浴器、水龙头等载体形成气溶胶。人体吸入气溶胶后引起军团菌感染[3-4]。随着人们生活水平的提高,人工冷热水系     

嗜肺军团菌对人体中性粒细胞NBT还原作用的影响

以ＮＢＴ还原试验微量比色法测定嗜肺军团菌对人体中性粒细胞氧化代谢的影响，发现经洗涤的活菌能激发嗜中性多形核白细胞（ＰＭＮ）的ＮＢＴ还原作用，而细菌培养物滤液在对ＰＭＮ无细胞毒性的浓度表现抑制ＮＢＴ还原的效应。     

广州市亚运接待宾馆酒店淋浴热水军团菌污染状况分析

目的对广州市亚运接待宾馆酒店淋浴热水的军团菌污染状况进行调查分析,提出相应的对策。方法采集广州市48间亚运接待宾馆酒店淋浴热水108份,按照卫生部《公共场所集中空调通风系统卫生规范》2006年附录A进行军团菌的检测。结果 108份淋浴热水中,10份淋浴热水共检出11株嗜肺军团菌,阳性率为9.3%;其中LP1、LP3、LP6血清型分别占45.5%、18.2%、36.4%;三星级、四星级和五星级宾馆酒店淋浴热水军团菌的阳性率分别为15.2%、11.1%和2.6%。结论广州市亚运接待宾馆酒店的淋浴热水存在嗜肺军团菌的污染,建议定期清洗消毒淋浴设施,并加强对淋浴热水中军团菌的监测,以防范军团菌病的发生。     

检测尿可溶性抗原早期诊断军团菌肺炎

检测尿可溶性抗原早期诊断军团菌肺炎上海医科大学中山医院肺病学研究室２０００３２王葆青，胡必杰，何礼贤，李锡莹，瞿介明５４只豚鼠随机分两组。实验组４３只，经气管或经皮肺穿刺注入１０５～１０６ＣＦＵ／ｍｌ嗜肺军团菌Ⅰ型（ＬＰ１）悬液０．３ｍｌ；对照组１１...     

162例婴幼儿非典型性肺炎患者抗MP、CP和LP抗体检测的临床意义

非典型肺炎(atyccal pneumonia,AP)是社区获得性肺炎(CAP)中的一种,引起AP病原体主要包括肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌等.本研究应用间接免疫荧光法(IIF)对162例婴幼AP患者血清进行抗肺炎支原体(mycoplasma pnemnoniae,MP)抗体、抗肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae,CP)抗体和抗嗜肺军团菌(Legionella pneumophile,Lp)抗体联合检测,现报道如下.     

上海市集中式中央空调冷却塔水嗜肺军团菌污染状况分析

目的了解上海市宾馆、大型商场、超市及写字楼中央空调系统嗜肺军团菌的污染状况。方法采集上海市100家公共场所集中式中央空调冷却塔水100份,经酸处理,以GVPC、BCYE、血平板进行菌落筛选,并应用生化反应鉴定,最后进行血清学分型。结果100份冷却塔水检出嗜肺军团菌的样本数为75份,检出率达75％（75／100）,其中宾馆、大型商场、超市、写字楼阳性率分别为80．6％、72．7％、72．7％、70％。75份检出水样中分离到76株军团菌,血清型别呈多样化,但以LPl为主,同一份水样同时检出2个型别的占总检出水样的1．3％（1／75）。结论上海市公共场所中央空调冷却水中嗜肺军团菌污染严重,血清型别呈多样化,对人群健康构成潜在威胁,需要引起重视,以防军团菌病的暴发流行。     

石家庄市不同人群呼吸道感染病原体调查分析

目的 了解本地区急性呼吸道感染患者8种呼吸道病原体的流行情况.方法 选取2014年1月1日至2015年12月31日在石家庄市第一人民医院诊治的7545例呼吸道感染患者,对血清进行8种常见呼吸道病原体的IgM抗体检测.结果 本地区2014年检出率较高的呼吸道病原体依次是流感病毒B(17.5％)、流感病毒A(12.9％)、肺炎衣原体(11.8％),2015年检出率较高的呼吸道病原体依次是流感病毒B(20.6％)、肺炎支原体(20.0％)、流感病毒A(11.0％).2015年较2014年流感病毒A、流感病毒B、肺炎衣原体、嗜肺军团菌4种病原体IgM抗体阳性率有所降低,肺炎支原体IgM抗体阳性率有所升高;各年龄组八种病原体抗体阳性率均存在差异,与0～3岁组比较4～15岁组肺炎衣原体、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、嗜肺军团菌、呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性率较高,15岁以上组腺病毒、嗜肺军团菌、呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性率较高;与4～15岁组比较15岁以上组腺病毒、嗜肺军团菌IgM抗体阳性率较高;且秋冬季与春夏季比较流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒IgM抗体阳性率较高,而肺炎支原体IgM抗体阳性率较低.结论 本地区呼吸道感染的病原体以流感病毒A(INFA)、流感病毒B、肺炎支原体为主,不同年份、不同季节、不同年龄组病原体的种类和感染率具有一定差异性.     

军团病的流行趋势及防治措施

军团病是1976年发现的人类急性发热性细菌性呼吸道病,由嗜肺军团菌引起,以肺炎为主要表现,常伴有全身多系统损害,也可表现为一种非肺炎的急性发热。20多年来,全球多起爆发流行,由于症状不典型,容易误诊误治,病死率高达25%～30%,是21世纪值得重视的感染病之一。     

嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答及其保护力

目的:研究嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫原性以及对LP感染小鼠的保护能力。方法:用嗜肺军团菌免疫原蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFNγ-产生水平和CTL特异杀伤活性等指标,以评价疫苗的免疫原性。真核表达重组质粒pcDNA3.1-ipDNA疫苗重复免疫BALB/c小鼠2次,末次免疫2周后,用10倍LD50剂量攻击小鼠,计数小鼠的存活数及小鼠肺中的细菌数,观察感染鼠的肺部病理变化。结果:pcDNA3.1-ip免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,免疫组的免疫原性和免疫保护性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P<0.01)。结论:免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗的侯选基因。     

军团菌逃逸巨噬细胞杀伤效应的分子机制研究

目的：通过体外构建军团菌感染的细胞模型，探索caspase 3激活与军团菌逃逸巨噬细胞杀伤作用的相互关系。 方法： 军团菌感染巨噬细胞后，用激光共聚焦显微镜和荧光阅读机测定胞内caspase 3的活性。并在caspase 3抑制剂应用前后对军团菌在发生凋亡的巨噬细胞内的生长复制状况进行检测。 结果： 激光共聚焦显微术以及caspase 3荧光底物的分析结果显示，嗜肺性军团菌毒力株感染巨噬细胞后能够大幅度激活caspase 3，而去除毒力的突变菌株不具备这种能力。军团菌在感染巨噬细胞后不同的时间内，军团菌在胞内不断地复制繁殖，而毒力去除的突变株却没有复制能力。当胞内caspase 3的活性被抑制后，军团菌毒力株的复制繁殖能力也有了显著性的抑制。 结论： 军团菌感染巨噬细胞后能够在极短的时间内激活 caspase 3,并通过诱导巨噬细胞的凋亡来逃逸巨噬细胞的杀菌作用和发挥致病效应。     

双色免疫为光菌团法快速检定嗜肺军团菌的研究

本文介绍快速检定嗜肺军团菌（ＬＰ）的双色免疫荧光菌团法。实验证明本法无非特异荧光菌团反应，敏感性较常规培养、玻片凝集和ＳＰＡ协同凝集试验高。是一种敏感、特异、快速和简便的新方法。适合于基层实验室采用。     

双色免疫荧光菌团法快速检定嗜肺军团菌的研究

本文介绍快速检定嗜肺军团菌（ＬＰ）的双色免疫荧光菌团法。实验证明本法无非特异荧光菌团反应，敏感性较常规培养、玻片凝集和ＳＰＡ协同凝集试验高。是一种敏感、特异、快速和简便的新方法。适合于基层实验室采用。