亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞SDH的影响

目的以琥珀酸脱氢酶(SDH)为指标,探讨亚精胺(Spermidine ,Spd)对日本血吸虫成虫培养细胞生长代谢的影响。方法将24 d龄的日本血吸虫成虫用冷消化法制成细胞悬液,联合法将细胞接种于小盖玻片上培养。培养至第4 d ,一部分细胞用含Spd终浓度分别为0(对照)、25、50、75、80、90、100、150、200μmol/L的无血清培养基处理24 h,另一部分细胞用终浓度为75μmol/L的Spd分别处理0(对照)、12、24、36、48、60、72 h。然后用PBS清洗3次,再换用常规培养基继续培养。至第8 d ,对处理过的培养细胞进行SDH细胞化学染色,Olympus-BH2显微镜下观察、拍照,并将结果输入HPIAS-2000图像分析仪进行图像分析。结果用Spd作用24 h,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随Spd浓度的升高逐渐增强,75μmol/L时达到最高,>75μmol/L,SDH活性逐渐减弱。当Spd作用浓度为75μmol/L时,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随着Spd作用时间的延长逐渐增强,48 h时达到最高,然后逐渐减弱。统计学分析显示,Spd处理后的实验组培养细胞,其SDH活性与对照组细胞比较差异具有显著性(P<0 .05) ;用终浓度为75μmol/L的Spd处理培养细胞48 h,培养细胞的SDH活性显著强于其余各组(P<0 .01)。结论Spd可显著增强日本血吸虫培养细胞的生长代谢活性;用终浓度为75μmol/L的Spd处理48 h,培养细胞的SDH活性最强。     

5-羟色胺体外对日本血吸虫母胞蚴

目的 研究5-羟色胺（5-HT）体外对日本血吸虫母胞蚴运动性和体长的影响,并筛选5-HT作用的最适浓度与时间。 方法 取感染6~8周日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化收集毛蚴,于1/2 RPMI 1640培养基（含10%小牛血清和常量抗生素）中培养48 h。待毛蚴转化为母胞蚴后,将一部分母胞蚴分别培养于浓度为0、0.1、1、10、100和1 000 μmol/L的5-HT培养基中48 h,另一部分母胞蚴用10 μmol/L 5-HT分别培养0.16、6、24和48 h,测定母胞蚴的活动率、体长与琥珀酸脱氢酶活力。 结果 用不同浓度5-HT培养母胞蚴48 h,随着5-HT浓度的增加,母胞蚴的活动率及体长均逐渐增加,浓度为10 μmol/L时两者均达到最大,分别为（65.6±1.5）%和（131.4±9.2） μm。用10 μmol/L 5-HT培养时,随着培养时间的延长,母胞蚴的活动率、体长、琥珀酸脱氢酶活力均逐渐增加,24 h时活动率达最大,48 h时体长最长和琥珀酸脱氢酶活力最强。 结论 5-HT能显著影响体外培养的日本血吸虫母胞蚴的运动性和体长,其作用的适合浓度为10 μmol/L。     

亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的影响

目的以日本血吸虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白(Argyrophilicnucleolarorganizerregionassociatedproteins,AgNORs)为评价指标,探讨亚精胺(Spermidine,Spd)对培养细胞的促增殖作用。方法采用联合法将虫龄为24d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,培养于常规培养基中。接种后第3天,随机分为实验组和对照组。将实验组细胞用无血清培养基配制的终浓度为75μmol/L的Spd处理48h,对照组细胞则用不含Spd的无血清培养基处理,时间相同;PBS清洗3次后换用常规培养基继续培养。于第7、14、21、28、35天分别对培养细胞进行AgNORs染色。使用HPIAS-2000图像分析系统,计算培养细胞核内AgNORs颗粒数及平均吸光值,并作统计分析。结果经Spd处理,各实验组培养细胞AgNORs着色明显深于对照组;但随着培养时间的延长,实验组与对照组细胞着色均逐渐变浅。各实验组细胞AgNORs颗粒数目与平均吸光值高于对照组,二者比较差异有统计学意义(u7=50.95、43.78;u14=55.23、43.54;u21=36.65、32.25;u28=31.6、32.95;u35=28.86、9.54;P<0.01)。各实验组AgNORs吸光值两两比较,除第7天与第14天之间差异无统计学意义外(q=0.008058,P>0.05),其余差异都有统计学意义(P<0.01)。结论Spd具有促进日本血吸虫培养细胞增殖的能力,每周用Spd处理培养细胞1次,能更大限度地促进血吸虫培养细胞的生长。     

PPARs激动剂对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 探讨PPARs激动剂吡格列酮对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 首先用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）将体外培养的RAW264.7巨噬细胞诱导分化为泡沫细胞,然后进行油红O染色,并在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化;再以不同浓度吡格列酮（0 μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L）作用泡沫细胞24h,以30 μmol/L的吡格列酮作用0h、6h、12h、24 h、48 h;最后酶法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①50 mg/Lox-LDL诱导巨噬细胞48 h后分化为泡沫细胞.②与对照组相比,不同浓度吡格列酮作用后泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈剂量依赖性.③与对照组相比,30 μmol/L的吡格列酮作用6h、12 h、24 h、48 h后,泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈时间依赖性.结论 PPARs激动剂吡格列酮能够减少泡沫细胞内胆固醇含量,且呈剂量和时间依赖性。     

EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞生长的影响

目的研究表皮生长因子(E GF)对用或未用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的促生长、增殖作用.方法将联合法接种培养至第3天的日本血吸虫成虫培养细胞,一部分在含EGF终浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、12、16、20、 24、28 ng/ml的附加20%小牛血清及常量抗菌素的RPMI-1640培养基中培养 ;另一部分,先用含MNNG终浓度为3 μg/ml附加20%小牛血清和常量抗生素的RP MI-1640培养基处理48h,再换用含终浓度分别为0、1、8、12、16、20 ng /ml的EGF培养基继续培养.每日用Olympus IM倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况.结果两实验组中,用不同浓度EGF处理后的日本血吸虫成虫培养细胞均在2周以后出现不同程度的脱落、退化;并且,随着EGF浓度的升高, 培养细胞脱落、退化的现象更加严重;两实验组相比,未用MNNG诱导的培养细胞出现脱落和退化现象的时间比用MNNG诱导的相对更早.结论外加EGF对用或未用MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞的生长增殖均无促进作用,相反,加速了培养细胞的老化,尤其是对未用MN NG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞,这种作用更加明显.     

CoCl2缺氧处理对脐带间充质干细胞促血管生长因子表达的影响

目的: 探讨氯化钴(CoCl2)模拟缺氧预处理对人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)中碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达及蛋白分泌的影响。方法: 分离、培养UC-MSCs。取第3代的UC-MSCs,运用含150 μmol/L的CoCl2培养液培养细胞72 h,用流式细胞仪检测缺氧对UC-MSCs表面标志物(CD34、CD45、CD90、CD105、CD29及CD49)的影响。依据CoCl2的浓度(0、50、100 μmol/L及150 μmol/L)将UC-MSCs分为4个组,即对照组、低、中、高CoCl2组,每个组处理24 h、48 h和72 h。用SYBRGREN荧光定量RT-PCR检测bFGF、VEGF mRNA的表达,用ELISA法检测bFGF和VEGF蛋白的表达。结果: 经含150 μmol/L CoCl2的培养液缺氧处理,没有改变细胞的形态和表面标记物。在缺氧培养时间相同的情况下,bFGF、VEGF基因的表达均随着CoCl2浓度的增加而增加,CoCl2为150μmol/L时达到峰值（P<0.05）。当CoCl2浓度为150μmol/L培养不同时间(24h、48 h及72 h)时,随着缺氧预处理时间的延长,bFGF、VEGF基因的表达随之增加,于48 h时达到峰值（P<0.05）,bFGF、VEGF基因的表达分别为8.15±0.10和16.67±0.17,延长缺氧培养的时间基因的表达减小（P<0.05）;蛋白与基因表达的变化基本一致。在含150 μmol/L CoCl2的培养液培养48 h,bFGF和VEGF的表达达到顶峰（P<0.05）,分别为(69.63±7.90) ng/L和(89.55±5.45) ng/L。结论: 适当浓度的CoCl2(<150 μmol/L)对UC-MSCs的生物学功能影响轻微。CoCl2可用于细胞的模拟缺氧,缺氧对UC-MSCs bFGF、VEGF的分泌具有时间和剂量依赖性,以含150 μmol/L CoCl2的培养液培养48 h,为促进bFGF、VEGF基因和其蛋白表达的最适条件。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷通过上调法尼酯X受体启动子甲基化水平抑制HepG2细胞载脂蛋白A表达

目的 探索5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）的DNA去甲基化作用对HepG2细胞载脂蛋白A（ApoA）表达的影响,并探讨其作用机制。方法 选取ApoA高表达细胞株HepG2细胞为研究对象。噻唑蓝法测定HepG2经不同浓度（0、10、20、40、80 μmol/L）的5-Aza-CdR处理不同时间（12、24、48、72、96 h）后细胞相对存活率;Western blot检测5-Aza-CdR不同浓度组HepG2细胞ApoA、法尼酯X受体（FXR）的表达水平;逆转录聚合酶链反应检测ApoA、FXR的mRNA水平;亚硫酸氢盐测序PCR检测FXR基因启动子在5-Aza-CR不同浓度组的甲基化水平。结果 与对照组相比,5-Aza-CR 10、20、40 μmol/L组在12、24、48、72 h各组间细胞存活率无统计学差异（P>0.05）,而在20 μmol/L 96 h组、40 μmol/L 96 h组、80 μmol/L 24 h组、80 μmol/L 48 h组、80 μmol/L 72 h组以及80 μmol/L 96 h组HepG2细胞存活率存在统计学差异（P<0.05）,选取0～40 μmol/L为5-Aza-CdR的安全浓度范围,0～72 h为合适作用时间。与对照组相比,5-Aza-CdR呈剂量和时间依赖性上调FXR蛋白、下调ApoA蛋白表达,其中以40 μmol/L组最为明显（P<0.05）;与对照组相比,5-Aza-CdR呈剂量依赖性上调FXR mRNA、下调ApoA mRNA表达,其中以40 μmol/L组最为明显（P<0.05）。随着5-Aza-CdR浓度的递增,FXR基因启动子甲基化水平呈下降趋势,其中对照组FXR基因启动子甲基化率为58.3%,而40 μmol/L组FXR基因启动子甲基化率仅为8.3%。结论 5-Aza-CdR通过DNA去甲基化作用促进FXR表达,从而下调ApoA的表达。     

诱导型环氧合酶-2在CD40配体诱导基质金属蛋白酶表达中的作用

目的: 探讨重组人CD40配体（rhCD40L）诱导U937细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）表达的作用及其与诱导型环氧合酶-2(COX-2)途径的关系。方法: 体外培养U937细胞,以不同浓度（0.1、0.2、0.4 mg/L）的rhCD40L和不同浓度（10-5 mol/L、10-4 mol/L、10-3 mol/L）的COX-2特异性抑制剂(NS-398)分别刺激24 h。在加入终浓度为0.4 mg/L rhCD40L的基础上,加入终浓度为10-4 mol/L的NS-398,共同刺激U937细胞24 h后,收集培养上清液,用酶谱法测定MMPs的活性。结果: rhCD40L可使MMP-2和MMP-9的活性明显增加（P<0.01）,且呈剂量依赖性;NS-398可抑制MMP-2和MMP-9的活性,且抑制作用随剂量的增加而增强（P<0.05）。结论: rhCD40L以浓度依赖的方式诱导MMPs表达,rhCD40L对MMPs的诱导作用可能与COX-2途径有关。     

羊膜上皮细胞对6-OHDA所致PC12细胞损伤的保护作用

目的 探讨羊膜上皮细胞（HAEC）对6-羟基多巴胺（6-OHDA）所致PC12细胞损伤的保护作用机制.方法 采用MTT检测、AO活体荧光素标记和流式细胞仪检测技术,观察加入终浓度分别为30、40、50 μmol/L的6-OHDA 24 h后,HAEC培养液上清对6-OHDA所致的P C 12细胞损伤的保护作用.结果 随着6-OHDA浓度的增大,PC12细胞活力逐渐降低,受损伤细胞的数量逐渐增加,终浓度为50 μmol/L的6-OHDA损害组可见细胞凋亡样改变;HAEC培养液上清可明显拮抗6-OHDA的毒性作用,使PC12细胞的存活率增加,受损伤细胞的数量降低.结论 HAEC培养液上清能拮抗6-OHDA所致的PC12 细胞损伤.     

硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用

目的:研究不同浓度的硫化氢(H_2S)对缺氧不同时间的乳鼠心肌细胞损伤的直接影响及其对复氧损伤的间接影响,分析其对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用.方法:原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧硫氢化钠(NaHS)0组、缺氧硫氢化钠 100 μmol/L组、缺氧硫氢化钠 200 μmol/L组、缺氧硫氢化钠400 μmol/L组以及缺氧-复氧硫氢化钠0组、缺氧-复氧硫氢化钠100 μmol/L组、缺氧-复氧硫氢化钠 200 μmol/L组、缺氧-复氧硫氢化钠 400 μmol/L组.在缺氧24 h、48 h、72 h后及复氧2 h后均检测细胞存活数量、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果:缺氧硫氢化钠100 μmol/L组、缺氧硫氢化钠200 μmol/L组和缺氧硫氢化钠 400 μmol/L组缺氧培养24 h、48 h和72 h后与各自时间点缺氧硫氢化钠0组比心肌细胞存活数量升高(P<0.01)、培养液中乳酸脱氢酶活性降低(P<0.01),差异均有统计学意义;缺氧硫氢化钠 200 μmol/L组和缺氧硫氢化钠 400 μmol/L组在缺氧培养24 h后较缺氧硫氢化钠100 μmol/L组心肌细胞存活数量升高(P<0.01)、培养液中乳酸脱氢酶活性降低(P<0.05～0.01),差异均有统计学意义.缺氧-复氧硫氢化钠100 μmol/L组、缺氧-复氧硫氢化钠200 μmol/L组和缺氧缺氧-复氧硫氢化钠400 μmol/L组缺氧培养24 h、48 h、72 h并复氧2 h后较各自时间点缺氧-复氧硫氢化钠0组比心肌细胞存活数量升高(P<0.01)、复氧后心肌细胞乳酸脱氢酶漏出量降低(P<0.01),差异均有统计学意义.结论:100~400 μmol/L 硫氢化钠对缺氧-复氧心肌细胞具有保护效果.200~400 μmol/L 硫氢化钠对缺氧24 h的心肌细胞保护作用较好.