乌司他丁通过上调PPAR-γ抑制低氧诱导的肺血管平滑肌细胞表型转换

目的探讨乌司他丁对低氧诱导的肺血管平滑肌细胞（PASMCs）表型转化的影响及其分子机制。方法体外培养SD大鼠 PASMCs,随机分组4组：正常组（N组）,常氧+乌司他丁组（NU组）,低氧组（H组）,低氧+乌司他丁组（HU组）,各组培养24 h后 采用免疫荧光检测SM-α-actin和Calponin表达水平,应用CCK-8法、3H-TdR和Transwell小室检测各组PASMCs增殖和迁移。 并分别利用Western blotting和荧光素酶报告质粒检测PPAR-γ蛋白表达和转录活性。采用PPAR-γ抑制剂GW9662进行预处理 干预乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转化的影响,分析干预后PASMCs增殖和迁移改变。结果低氧条件下,乌司他丁能 促进PASMCs 中SM-α-actin 和Calponin 的表达（P<0.05）,抑制PASMCs 的增殖和迁移能力（P<0.05）,同时乌司他丁上调 PPAR-γ的表达（P<0.05）。采用GW9662预处理后,乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转换的抑制作用显著下降（P<0.05）。 结论乌司他丁通过上调PPAR-γ抑制低氧诱导的PASMCs表型转换。     

Akt3基因在低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞体外增殖中的作用

目的 通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(Akt3)mRNA及其蛋白表达水平变化与低氧PASMC增殖的关系,探讨Akt3在低氧肺血管重建中的调控作用.方法 组织块法培养PASMC.采用半定量RT-PCR技术检测常氧组(N组)和低氧2、8、12、24h组Akt3基因mRNA表达水平;采用Western blot技术检测相应蛋白表达水平.采用MTT法、3H-TdR掺入法检测PASMCs增殖改变.结果 低氧诱导PASMCs不断增殖.各组均检测出Akt3基因mRNA以及蛋白表达变化,图像定量分析光密度值显示各组表达mRNA以及蛋白表达与细胞增殖改变密切相关.结论 Akt3基因可能在低氧肺动脉高压中调节PASMC增殖.     

人胚胎间充质干细胞向平滑肌细胞定向分化标志蛋白的选择

目的:选择平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)特异性标志蛋白,作为判断人胚胎间充质干细胞(mesenchymalstem cell,MSC)是否向SMC方向分化的指标.方法:采用免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹和RT-PCR等方法,检测SMC分化早、中、晚期标志蛋白smooth muscle(SM)-α-actin、calponin、SM-myosin heavy chain(SM-MHC)在人胚MSC中的表达情况.结果:各实验均证明SM-α-actin和calpomn蛋白在人胚MSC中表达.各种实验方法在人胚MSC中均检测不到SM-MHC蛋白及其mRNA的表达.结论:SM-MHC是一个有价值的SMC特异性标志物,可以做为判断人胚MSC向SMC方向分化与否的指标.     

西地那非抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道的下调作用

目的探讨西地那非对低氧下调人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channels,Kv)的干预作用。方法应用膜片钳技术记录PASMCs K+电流;观察低氧刺激前后钾离子(K+)电流的变化以及西地那非(sildenafil)的干预作用;通过特异性Kv1.5抗体透析,分析西地那非作用于人PASMCs Kv分子靶点即通道亚单位;运用Real-time PCR及Western blotting技术检测低氧刺激前后及西地那非对人PASMCs上的Kv1.5通道基因转录水平和蛋白表达水平的影响。结果低氧明显抑制了人PASMCs细胞膜上的全细胞K+电流;而西地那非则可以对抗低氧对全细胞K+电流的抑制作用;而且西地那非对低氧下人PASMCs Kv的调控作用靶点主要是Kv1.5;同时西地那非部分恢复了低氧抑制的细胞上的Kv1.5 mRNA和蛋白表达。结论西地那非能够抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道功能与表达的下调作用。     

缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞Akt mRNA表达的变化

目的通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）3种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt1、Akt2、AkG）mRNA的表达水平变化,初步探讨Akt信号途径在缺氧肺动脉高压（hypoxia pulmonary hypertension,HPH）血管重建中的作用。方法组织贴片法建立纯PASMC细胞系。采用半定量RT-PCR技术检测常氧组（N组）、低氧2、8、12、24组的Akt1、Akt2和AkG基因mRNA的表达水平。结果建立了纯PASMC细胞系。各组均检测出Akt1、Akt2和AkG基因的mRNA,图像定量分析光值显示各组表达的mRNA含量与缺氧时限存在一定的关系。结论Akt信号通路可能是大鼠缺氧肺动脉高压中PASMC增殖和分化的重要传导途径,其中Akt1可能起主要作用。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞中Gax基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中生长终止特异性同源盒(growth arrest-spec ific homeobox,Gax)基因表达及细胞增殖的影响。方法以RT-PCR法、免疫细胞化学法和W estern blot法测定经低氧处理后的大鼠PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达3。H-TdR掺入法观察低氧处理后PASMCs增殖情况。结果RT-PCR、免疫细胞化学和W estern blot检测证实低氧(2.5%O2)处理后的PASMCs中Gax mRNA和蛋白的表达逐渐降低;与常氧组比较,低氧组Gax mRNA和蛋白的表达显著下降3。H-TdR掺入法测定结果示PASMCs3H-TdR掺入量在低氧6 h开始增加,随着低氧时间延长,3H-TdR掺入量逐渐增加,至低氧24 h时3H-TdR掺入量最高。结论低氧可下调大鼠PASMCs中Gax mRNA和蛋白的表达并诱导PASMCs增殖,提示Gax基因在低氧性PASMCs增殖过程中可能起着重要作用。     

胰岛素下调AP-1抑制血管平滑肌α肌动蛋白的表达以及对细胞增殖的影响

目的研究胰岛素诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)转录因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)表达下调对VSMC表型转换标志蛋白α肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,SM-α)表达调控及细胞增殖的影响。方法流式细胞术检测不同浓度(0、25、50、100、125 nmol/L)的胰岛素刺激VSMC 24 h后的细胞周期。设计AP-1表达质粒载体,转染至血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)。分为4组:空白对照组、胰岛素实验组、AP-1表达载体组、胰岛素+AP-1表达载体组。分别采用Western blot、RT-PCR检测AP-1蛋白及SM-α蛋白的表达及mRNA水平。结果细胞周期分布结果显示,不同浓度的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比升高至峰值后开始下降[(23.49±1.17)%、(28.08±0.68)%、(30.44±1.77)%、(47.47±0.88)%、(46.23±1.65)%,P<0.05],100 nmol/L的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比达到峰值(47.47±0.88)。RT-PCR及Western blot检测结果显示,胰岛素刺激VSMC可下调AP-1[(0.47±0.09)、(0.46±0.14),P<0.05]及抑制SM-α的表达[(0.41±0.03)、(0.32±0.03),P<0.05]。结论胰岛素能下调转录因子AP-1表达,进而抑制表型转换标志蛋白SM-α的表达,诱导VSMC发生增殖。     

容量激活性氯离子通道在大鼠低氧性PASMCs中的表达及与p38MAPK通路的关系

目的 探讨容量激活性氯离子通道（CLC3）在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）中mRNA和蛋白表达的变化以及其与p38MAPK信号通路的关系.方法 取10只雄性SD大鼠,用酶消化法获得PASMCs并且进行原代培养,用小鼠抗大鼠SMα-actin免疫荧光细胞化学的方法进行鉴定.经培养鉴定的PASMCs随机分为：常氧组（N组,n=6）,低氧组（H组,n=6）,DMSO对照组（D组,n=6）,SB203580干预组（SB组,n=6）,Anisomycin干预组（A组,n=6）,用免疫印迹技术检测CLC3蛋白的表达,半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定CLC3 mRNA水平的表达.结果 与N组比较,H组PASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达量均显著上调（P均＜0.01）;与D组比较,SB组CLC3 mRNA和蛋白的表达均上调（P均＜0.01）,A组mRNA的表达明显下调（P＜0.01）,蛋白的表达轻微下调（P＞0.05）.结论 低氧可上调大鼠PASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达;p38MAPK通路抑制剂SB203580能上调PASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达;p38MAPK通路激活剂Anisomycin可下调PASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达.     

低氧对大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞功能的影响

目的培养鉴定大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞（ pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,探讨其对缺氧刺激反应性的不同。方法酶消化法分离大鼠不同级别PASMCs并分为3组：大肺动脉组,包括肺动脉干及肺内一级主干;中动脉组,包括肺内主干的第二级和第三级分支;小肺动脉组,包括肺内主干四级分支后的更细小分支。分别给予常氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、21%O2、37益）和低氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、3%O2、37益）培养48 h,用四甲基偶氮唑盐（ methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法和Western blotting检测增生细胞核抗原（ proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的蛋白表达水平的方法检测细胞的增生能力;应用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。结果倒置显微镜下PASMCs呈现长梭形,免疫荧光法检测平滑肌细胞标志物即平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）为阳性,生理情况下（常氧）,3组肺动脉平滑肌细胞增生及迁移能力均较一致;低氧培养48 h后,中小肺动脉平滑肌细胞的增生与迁移能力均显著高于大动脉,PCNA结果与MTT结果一致,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论在低氧条件刺激下,不同级别肺动脉平滑肌细胞反应性不同,中小肺动脉平滑肌细胞的增生及迁移能力均显著高于大肺动脉平滑肌细胞。     

体外诱导血红素氧合酶-1表达对抗PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞表型转化的作用

目的探讨体外诱导血红素氧合酶-1(HO-1)表达对血小板源性生长因子-BB (PDGF-BB)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(Vascular Smooth muscle Cell,VSMC)表型转化的影响。方法用贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞,分别给予PDGF诱导VSMC表型转化,并给予不同浓度的氯血红素诱导HO-1表达。采用免疫荧光和免疫组织化学法分别检测VSMCα肌动蛋白(SM-α-actin)和细胞核增殖抗原(PCNA)的表达,RT-PCR检测不同组HO-1mRNA的相对表达水平。结果与对照组比较,PDGF-BB诱导后VSMC SM-α-aCtin的表达明显减少,PCNA表达明显增多,同时给予PDGF和氯血红素诱导HO-1的表达随着氯血红素剂量的增加SM-α-actin的表达增加,PCNA表达减少。RT-PCR结果表明HO-1mRNA的表达与氯血红素的剂量正相关。结论体外诱导血红素氧合酶-1的表达可以抑制PDGF-BB诱导的VSMC表型转化,这种作用和HO-1表达的强度正相关。