VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

携带入VEGF165的腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5基因的重组腺病毒载体 ,用于治疗重症冠心病。方法　将人VEGF16 5cDNA正向插入到穿梭质粒 pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,即pAd hVEGF16 5 ,通过脂质体与pJM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人VEGF16 5基因的重组腺病毒载体Ad hVEGF16 5。通过PCR扩增法鉴别Ad hVEGF16 5 ,根据A2 60nm计算病毒滴度。结果　人VEGF16 5cDNA成功地正向插入到 pHCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 5 76bp的VEGF16 5cDNA基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad hVEGF16 5的正确性。测病毒滴度为 1.94× 10 12 pfu/ml。结论　携带人VEGF16 5的腺病毒载体的成功构建为用VEGF16 5基因治疗冠心病奠定了基础。     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定

背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.     

重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达

目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15。在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15。随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010 PFU/mL。结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础。     

EGFP标记的hVEGF165重组腺病毒构建新方法及其相关特性的体外研究

利用细菌内同源重组法快速构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF165)重组腺病毒载体 ,并对其相关特性进行体外研究。首先将hVEGF165cDNA亚克隆到含EGFP基因的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV中 ,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1共同电击转化大肠杆菌BJ5183 ,同源重组获得重组腺病毒质粒 pAd EGFP/hVEGF165,鉴定后通过脂质体法转染HEK2 93细胞 ,产生重组腺病毒Ad EGFP/hVEGF165。通过体外试验观察病毒的形态、均一性和安全性 ,靶细胞的感染效率及hVEGF165的表达情况。结果显示 ,通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP/hVEGF165;借助于EGFP的表达 ,直接在荧光显微镜下观测到靶细胞的感染效率和外源基因的表达。经纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 2× 10 12 pfu/ml。病毒感染Hela细胞后经多次传代未见细胞病变。以感染复数 (MOI) =10 0感染hUVEC可获得最大增殖刺激作用。同样浓度感染小鼠骨髓单个核细胞效率达 2 7.3% ,培养上清中hVEGF165蛋白含量达 1385± 332 pg/ 10 6cells。结论 :细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,辅以EGFP为标记基因可以直观检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。利用该     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

治疗基因VEGF_(165)和报告基因NIS共表达载体的构建和鉴定

目的:利用内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建含有血管内皮生长因子(VEGF165)和人钠碘同向转运体(NIS)的真核双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,并在体外检测NIS蛋白和VEGF165蛋白在HEK293细胞中的表达。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到目的基因VEGF165和NIS,通过酶切将其连接克隆至pIRES载体以构建pIRES-VEGF165-NIS质粒,再通过脂质体将构建好的质粒转染入HEK293细胞,并采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测VEGF165和NIS蛋白的表达。结果:成功构建了双基因双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,且其受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控。蛋白印迹法检测显示,VEGF165和NIS可同时在HEK293细胞中表达,而免疫荧光显示转染的HEK293细胞可同时表达VEGF165蛋白和NIS蛋白。结论:IRES序列调控VEGF165和NIS双基因可在细胞中同时独立表达,为进一步构建双基因表达重组腺病毒,并利用人NIS作为报告基因,实时监测VEGF165治疗基因的表达和分布奠定基础。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定

目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广.实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室).①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠.②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷犁重组腺病毒.⑧实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因.并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度.结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TIC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒.②重组腺病毒Ad.VEGFl65的鉴定:聚合酶链反应的产物进行Nco I酶切鉴定,可得到597 bp、146 bp 2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfa/L.结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全.     

重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP的构建与鉴定

目的:转录因子Olig1调控了少突胶质前体细胞的分化和成熟,并参与了脱髓鞘损伤后的修复,是治疗脱髓鞘疾病的候选基因,在缺血性脑血管病的治疗中具有极大的应用价值。本实验旨在构建携带Olig1基因的重组腺病毒载体。方法:pDC315-Olig1为模板,聚合酶链反应扩增酶切Olig1片段,连接到带有eGFP标记基因的载体质粒pDC315-eGFP上,构建穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP,经PCR,酶切及测序鉴定后,利用AdMax包装系统,通过脂质体2000的介导与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组后产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,应用PCR对毒种进行鉴定,传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:经聚合酶链反应,酶切鉴定和测序分析,得到大小700bp(Olig1)目的片段,证实正确构建重组穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP和重组腺病毒Ad5-Olig1-eGFP,测得重组腺病毒颗粒数为2.3×1011v.p./mL。结论:成功构建携带Olig1的重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,为缺血性脑血管病的基因治疗提供基因载体并奠定实验基础。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1080bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

小鼠角质细胞生长因子重组腺病毒载体的构建

目的 探讨构建表达小鼠角质细胞生长因子(KGF)基因重组腺病毒载体的方法.方法 提取小鼠肺组织RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA后,PCR扩增目的基因片段.将获得的KGF基因插入载体质粒pShuttle-CMV,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-KGF(pKGF).线性化pKGF后,转化入含AdEasy-1病毒骨架的BJ5183细菌中.筛选正确的同源重组质粒pAdEasy-1-pShuttle-CMV-KGF(pAd-KGF),转染HEK293细胞,产生病毒颗粒AdEasy-1-pShuttle-CMV-KGF(Ad-KGF).进一步大量扩增病毒,氯化铯梯度离心纯化,测定病毒滴度.制备病毒Ad-GFP为对照,显微镜下观察转染率.结果 ①经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pKGF构建成功;②限制性内切酶酶切确定穿梭质粒重组于病毒骨架;显微镜下观察HEK293细胞形态,证实病毒包装复制成功;③病毒滴度3.0×1010 pfu/ml,达到进一步体内、外实验要求.结论 成功构建了重组腺病毒Ad-KGF,为了解KGF在肺部疾病中的作用以及进一步的基因治疗肺纤维化方法奠定了基础.     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

含人Apelin-R重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP的构建

目的 构建含有人Apelin受体(Apelin-R)基因的pDC316-apelinR-EGFP腺病毒穿梭载体,为糖尿病相关基因Apelin的体内研究提供新方法.方法 PCR方法分别扩增Apelin-R基因,测序正确后与载体pDC316-EGFP连接,构建重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP;脂质体法与腺病毒骨架载体共转染HEK293细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度.RT-PCR和Western blot方法检测Apelin-R的表达.结果 限制性核酸内切酶鉴定及测序结果均证明Apelin-R基因成功扩增并克隆到重组腺病毒载体pDC316-apelinR-EGFP.在HEK293中成功包装出含Apelin-R的腺病毒Ad-apelinR-EGFP,病毒滴度为3.1×109 TCID50/ml,感染Ad-apelinR-EGFP的HEK293E细胞中可检测到Apelin-R的mRNA和蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pDC316-apelinR-EGFP,得到了表达绿色荧光蛋白的Apelin-R腺病毒,该病毒有望用于糖尿病的体内研究实验.     

人护骨素转基因抑制破骨细胞功能的研究

背景转基因治疗骨科系统疾病一直是骨科治疗的难点,构建携带有效基因的病毒是目前治疗因破骨细胞功能异常亢进的骨骼系统疾病的研究方向. 目的构建携带人护骨素(human osteoprotegerin,hOPG)基因的重组腺病毒及其在大鼠体内共同表达.设计单一样本研究.单位解放军第三军医大学大坪医院全军战创中心骨创科.材料实验在解放军第三军医大学烧伤研究所移植免疫实验室完成.材料质粒PUC19-hOPG;穿梭质粒pAdTrack-CMV及腺病毒基因组pAdeasy-1,293细胞株;限制性内切酶 EcoRI,EcoRV,BamHI,KpNI,PmeⅠ,PacⅠ,PCR引物.方法将hOPG基因片段插入到含有GFP基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带hOPG和GFP基因的重组腺病毒(Adeasy-Adtrack-CMV-hOPG,Ad-hOPG).经大鼠尾静脉注射109 pfu的Ad-hOPG,在不同时相处死大鼠取其心、肝、肾、脾等组织观察重组腺病毒在体内表达特点.主要结局观察①重组质粒转染293细胞后,观察是否有绿色荧光蛋白的表达.②所获得的重组腺病毒基因组是否含有hOPG基因.③重组腺病毒Ad-hOPG所携带的基因是否能在大鼠体内表达蛋白,及表达时象特点.结果成功地构建了高滴度的携带hOPG基因的重组腺病毒,并能在体内大量表达,长达24 d.结论成功的构建了高滴度的Ad-hOPG,并初步取得了hOPG重组腺病毒体内表达特点.     

以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达

背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位。设计:随机对照实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1( )/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠;pDsRed1-N1由ProfessorRogerY.Tsien,UniversityofCalifornia,SanDiego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-Tcells由本实验室保存。方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达。激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况。结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。