风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a（＋）,并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

TEM-105编码基因的克隆与原核表达

由于一种细菌可同时产生多种 β内酰胺酶 ,因此为了避免多种 β内酰胺酶的相互干扰 ,我们应用肉汤稀释法[1] 对产超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs)的 4株肺炎克雷伯菌 (Kpn)的TEM型编码基因进行了原核表达。一、材料和方法1 菌株来源和表型鉴定 :4株临床菌株№ 95、№ 96、№ 10 2和№ 10 6为浙江省台州第一医院内科患者痰标本分离的Kpn。经抑制剂增强的肉汤稀释法[1] 证实为阳性。2 细菌质粒DNA提取与PCR扩增 :采用碱裂解法提取质粒DNA。根据TEM 1D编码基因序列设计的TEM引物序列为 5′ TTAGACGTCAGGTGGCACTT 3′ (76～ 95 )…     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。     

血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点.目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体.设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.材料:成年雄件SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMDl8-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存.方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMDl8.T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证.测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体.主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2.EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体.结果;①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致.②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中.结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体.     

融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达

本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1。构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET—hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX—hJagged1在上清中有较大量表达。诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了原核表达载体pET—ldaggedl（Bg1Ⅱ）、pET—hJagged1（Hind1）及pET-hJagged1（stuI）,但仅pET—hJagged1（StuI）表达可溶性的TRX—hJagged1。通过镍柱纯化获得了较单一的TRX—Jagged1蛋白,WesternBlot证实了其为目的蛋白。结论：成功地构建了原核表达载体pET—hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融舍蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

FUT3基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

背景：研究发现，Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切，岩藻糖基转移酶（fucosyltransfemse，FUTs）是参与合成Lewis抗原的关键酶，FUT3是其中之一。目的：设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒，为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-05，10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。材料：BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits（含荧光基因GFP）、T4DNA连接酶购自invitmgen公司；大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。方法：根据Gen Bank中FUT3的序列，应用www．invitrogen．com网站的设计软件设计、合成针对FUT3miRNA的相应Oligo DNA，退火后与BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector相连接，转化感受态Ecoli TOP10。主要观察指标：①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。结果：经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FuT3基因的miRNA干扰质粒pcDNA^TM 6．2-GW／Em GFP-FuT3-miR；质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。结论：FUT3靶向miRNA表达载体构建成功。     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.     

构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

人β防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

目的构建人β-防御素2的融合性原核表达载体，为今后基因工程手段表达纯化及生产人β-防御素-2奠定基础。方法体外基因合成人β-防御素2（HBD-2）的基因片段，并克隆人pMD18T中间载体中，经酶切鉴定后再克隆人pET32a原核表达载体中，与载体中所固有的TrX—A形成融合基因。结果构建的融合性原核表达载体经酶切鉴定无突变发生。结论成功地构建了pET-32a-（HBD-2）。     

人Flt3全长基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的克隆人Flt3全长基因,构建PGE/Plt3逆转录病毒表达载体。方法以人骨髓cDNA等基因文库为模板,采用分段克隆、人工PCR延伸及PCR连接等方法,获得了人Flt3全长基因,并构建Flt3基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆Flt3全长基因和构建PGEZ/Flt3逆转录病毒表达载体。结论F1t3全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功,为构建Flt3转基因细胞和制备抗人Flt3单克隆抗体和研究Flt3的生物学功能奠定了物质基础,也为低丰度和长片段基因克隆提供了有价值的经验。     

HCV-NS3抗原基因的克隆表达及活性测定

[目的]研制新的更符合我国HCV感染株的NS3抗原，以进一步提高HCV免疫检试剂的灵敏度。[方法]对HCV／NS3（1192-1457aa）片段序列进行在线Blast分析，根据共有序列（consensus）设计并合成引物。以Trizol法从病人血清中提取总RNA，经反转录PCR扩增获得NS3相应目的基闪，插入载体、经测序正确后，克隆表达，表达产物经纯化后用间接ELISA法测定其反应活性。[结果]从病人血清中获得了NS3部分基闪片段，测序证明所获得的序列和我们以前的la型NS3序列有18个不同的氨基酸残基。重组新NS3抗原经活性测定，反应灵敏度有较大提高。[结论]新获得的HCV-NS3可用于试剂盒抗原，以提高对我国HCV感染病人检测的灵敏度。     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

p21Ha-ras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

目的：构建PET-28a（＋）Ha-ras原核表达质粒，并表达、纯化得到p21ras蛋白，为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础。方法：培养人肝癌细胞株7703，提取总RNA，通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA，然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras．重组质粒PMD-18T vector-Ha-ras经过BamH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA．将PET-28a（＋）同样经过BarnH I和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段，将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a（＋）定向连接，构建出重组质粒PET-28a（＋）-Ha-ras，经酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的PET-28a（＋）．Ha-ras转入感受态BL-21（DE3）中诱导表达，利用组氨酸“标签”（His-Tag）对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆入PET-28a（＋）的Ha-ras序列与Genbank登录号为“NM_005343”的Ha-ras cDNA序列一致，将重组质粒PET-28a（＋）．Ha-ras转化BL21（DE3），用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS、PAG和蛋白纯化结果表明，PET-28a（＋）-Ha-Ras在E-coli中获得可溶性高表达，经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白。结论：成功构建了原核表达载体PET-28a（＋1）-Ha-ras，并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白，从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础。     

EBV-LMP1 cDNA克隆与真核表达载体的构建及体外表达

目的：从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达。方法：利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1 cDAN,克隆人pDrive Cloning Vector并测序,利用引物上设计的酶切位点Nhel和EcoRI将LMP1插入真核表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转梁COS细胞,采用RT-PCR和Westrn blot 检测LMP1的表达。结果：扩增的LMP1 cDNA为1301bp,核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该表达质粒在体外转梁COS细胞后可表达LMP1分子。结论：实验所构建的pIRES-LMP1表达质粒能在体外表达LMP1分子。     

副溶血弧菌TDH基因的克隆与表达

目的　对副溶血弧菌TDH基因进行克隆、鉴定与表达 ,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究TDH的功能奠定基础。方法　用聚合酶链反应 (PCR)扩增TDH基因将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体 pQE10 0构建表达TDH的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经双酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS PAGE电泳。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 2 4 0 0 0。结论　TDH基因成功克隆到表达质粒内并表达 ,为制备单抗、诊断试剂与其致病机制研究奠定了基础。     

原核表达载体pGEX-4T-1/Snapin的构建和表达鉴定

目的构建pGEX-4T-1/Snapin原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,以纯化得到Snapin/GST融合蛋白。方法用RT-PCR从小鼠血小板RNA中扩增Snapin基因。将目的片段装入原核表达载体pGEX-4T-1并转化至大肠埃希菌E.coli DH5α中,经过IPTG诱导,SDS-PAGE及凝胶扫描分析目的蛋白的表达水平。结果成功获得小鼠Snapin基因并构建得到重组表达质粒pGEX-4T-1/Snapin。筛选获得pGEX-4T-1/Snapin/E.coli DH5α重组转化菌株,诱导表达得到融合蛋白Snapin/GST。结论成功构建小鼠Snapin原核表达载体,并在E.coli DH5α中高效表达融合蛋白Snapin/GST,为深入研究Snapin蛋白的生物学结构和功能奠定基础。     

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。